超高分辨率 顯微成像系統(tǒng)iSTORM VINO版
超高分辨率 顯微成像系統(tǒng)iSTORM VINO版
超高分辨率顯微成像系統(tǒng)iSTORM ，綜合運用了 TIRF、dSTORM、STORM、PALM等多種成像技術(shù)，得到了超高分辨率、超穩(wěn)定、超便捷的成像方法，成功實現(xiàn)了光學顯微鏡對衍射極限的突破，使得在 20nm的分辨率尺度上從事生物大分子的單分子定位與計數(shù)、亞細胞及超分子結(jié)構(gòu)解析、生物大分子生物動力學等研究成為現(xiàn)實，給生命科學、醫(yī)學等領(lǐng)域帶來重大突破。超高分辨率顯微成像系統(tǒng) iSTORM 具有 20 nm超高分辨率、3通道同時成像、3D同步拍攝、實時重構(gòu)、2小時新手掌握等特點，配套活細胞系統(tǒng)，可實時無標記檢測樣品，并提供熒光染料選擇、樣本制備、成像服務與實驗方案整體解決方案，以納米級觀測精度、高穩(wěn)定性、廣泛環(huán)境適用、快速成像、簡易操作等優(yōu)異特性，獲得了超過50家科研小組和100多位科研人員的高度認可。歡迎預約試拍！聯(lián)系電話0512-81868806 17788523055。
成功實現(xiàn)2014年諾貝爾化學獎-隨機光學重建STORM技術(shù)原理的產(chǎn)業(yè)化，加入柱面鏡設(shè)計，在XY軸分辨率達20nm、Z 軸分辨率達 50nm，突破衍射極限，實現(xiàn)3D成像功能。
采用專有的多通道同時成像的光路設(shè)計，提供穩(wěn)定的光路。自主開發(fā)的成像分光光路，可保證通道間的光學路徑相對獨立，使得樣品發(fā)出的熒光最大效率地被探測器接收，最大限度降低通道間的串擾。并配合以最佳染料方案和最佳成像緩沖液配方，以多通道同時成像的方式，在幾分鐘到十幾分鐘的時間范圍內(nèi)實現(xiàn) 20nm 的超高分辨率成像。
采用標準的樣品制備以及緩沖液配方protocol，解決了超高拍攝樣品難以制備的問題，經(jīng)過優(yōu)化的樣本制備方案，僅需3步即可上機檢測，“傻瓜式”操作，易學易用，新手2個小時簡單培訓即可上機獲得理想的超高分辨率顯微成像結(jié)果。
采用納米級實時動態(tài)鎖定技術(shù)，以實時物理補償方式糾正樣品漂移，無需預熱、即開即用、操作簡便，免受如氣流、溫度變化、噪音、機械振動等環(huán)境問題對樣品位置的影響，在高樓層、嘈雜、震動、常溫常態(tài)的環(huán)境下也能穩(wěn)定成像，具有高效、簡便、對環(huán)境適應性好的特性，非常友好易用。
Hela 細胞中順式高爾基體網(wǎng)絡蛋白 GM 130 和反式高爾基體 網(wǎng)絡蛋白 Golgin 97 的雙通道超高分辨率成像。（a）寬場成像顯 示兩個蛋白局部重疊；（b）超高分辨率成像清晰顯示兩個蛋白分 別位于高爾基體的兩個層面。
酵母細胞中紡錘極體的微管蛋白 Tub1 和 Tub4 的雙通道超 高分辨率成像，兩種蛋白分布構(gòu)建了 GFP 和 RFP 的重組蛋白，再 用 GFP 納米抗體和 RFP 納米抗體分別進行免疫熒光染色。圖（a） 和圖（b) 為寬場成像，圖（c) 和圖（d）為相應的超高分辨率成像。 圖（b) 為圖（a) 所框區(qū)域的放大，相應的超高分辨率圖像（d) 清 晰顯示紡錘微管蛋白錨定到紡錘極體。
COS-7 細胞中線粒體的三維超高分辨率成像。線粒體外膜蛋 白 Tom20 采用間接免疫熒光標記。外膜蛋白勾勒的線粒體呈中空 結(jié)構(gòu)，寬場成像或共聚焦顯微鏡成像難以捕捉如此清晰的結(jié)構(gòu)特 征。z 軸的位置信息用顏色梯度表示。
力顯智能科技三通道超高分辨率成像。圖 (a) 為 COS7 細胞的線粒體外膜蛋白 TOM20（紫色）、線粒體基質(zhì)蛋白 COX IV（藍色）和 高爾基體 TGN46（綠色）的超高分辨率成像。圖 (b) 為 COS7 細胞的線粒體外膜蛋白 TOM20（紅色）、核膜蛋白 lamin（藍色）和高爾 基體蛋白 TGN46（綠色）的超高分辨率成像。
| iSTORM-VINO2CM | ||
| XY 分辨率 | ~20nm由自動對焦穩(wěn)控 | |
| TIRF功能 | 完全集成，TIRF/HILO/EPI照明方式可方便調(diào)節(jié) | |
| 多通道成像 | 匹配 單/雙/三 通道同時成像，全息成像: x，y軸分辨率200nm，z軸分辨率400nm。熒光成像：x，y軸分辨率400nm | |
| 物鏡 | 60X物鏡，NA0.8，空氣鏡，可選配100X油鏡 | |
| 成像方式 | 2D/3D可切換，360度旋轉(zhuǎn)光源干涉全息掃描，基于細胞物理折射率RI成像，對細胞無損傷；支持單染料dSTORM成像模式，對染料選擇給出多種商業(yè)化染料供參考，并提供相應的成像緩沖液配方（獨家研發(fā)，專利保護）多通道同時成像模式 | |
| 成像視野 | 培養(yǎng)皿：可完成 10×10 FoV 拼接（700μm×700μm），96 孔板：可完成5x5FoV拼接(300μmx300μm)，單個 FoV:RI: 80μmx80μmx30μm，熒光:80μmx80μm | |
iSTORM 可以實現(xiàn)單分子定位于計數(shù)，通過定位與計數(shù)可以實現(xiàn)對亞細胞結(jié)構(gòu)以及大分子復合
物結(jié)構(gòu)的解析以及生物動力學的分析。iSTORM 也整合了 SPT 的功能，具體的應用可以參考我們的產(chǎn)品手冊
STORM 的原理實質(zhì)是通過時間換空間的方式實現(xiàn)了對衍射極限的突破，時間分辨率相對不高。通常情況下做活細胞超高不容易，但我們力顯智能的 iSTORM 已經(jīng)實現(xiàn)了活細胞的超高拍攝。
另外，我們的系統(tǒng)還可以實現(xiàn)單顆粒追蹤（Single Particle Tracking, SPT）。在分子密度不高的情況下，可以實現(xiàn)單個分子或者納米尺度顆粒在活細胞內(nèi)的追蹤?？捎糜诜肿由飳W機制、生物學過程的研究以及藥物篩選。
iSTORM 使用的染料需要在緩沖液的配合下具有光切換的性質(zhì)，例如熒光染料 Alexa 系列中的幾種，Atto 系列中的幾種；特定的熒光蛋白；量子點；或者其他經(jīng)過處理、測試后具有光切換性質(zhì)的染料等；
共聚焦實驗中使用的染料需要具有穩(wěn)定發(fā)光、不易光漂白、亮度高的性質(zhì)；
因而適用于 STORM 和共聚焦的染料各有不同；
力顯在此領(lǐng)域有豐富的技術(shù)經(jīng)驗，使用力顯的整體解決方案，可以快速、高成功率的獲得實驗
結(jié)果。
跟共聚焦比簡單來說：兩點我們不能做 1.不能層掃 2.不能活細胞長時間連續(xù)拍攝，其它共聚
焦能做的我們都能做。
iSTORM 可以提供比共聚焦高 10 倍的空間分辨率，可以提供樣品內(nèi)單分子的定位、計數(shù)、軌
跡追蹤等信息；
iSTORM 的成像速度比共聚焦慢，但是目前力顯的活細胞 STORM 成像可以做到幾秒鐘完成一
張超高圖片的拍攝，同時正在研發(fā)的基于深度學習的空間分辨率提升技術(shù)可以將成像時間進一步縮短，有望達到共聚焦的水平；
iSTORM 的樣品制作需要一些經(jīng)驗，使用的染料需要在緩沖液的配合下具有光切換的性質(zhì)，并
且需要與硬件拍攝、數(shù)據(jù)處理進行配合，從而得到超分辨率圖像，因而使用上有一些門檻，但是力顯在此領(lǐng)域有豐富的技術(shù)經(jīng)驗，使用力顯的整體解決方案，可以快速、高成功率的獲得實驗結(jié)果。
超高是指突破了衍射極限的光學顯微成像系統(tǒng)。由于光存在衍射極限，無論顯微鏡做的如何精
密，一般在 xy 平面 200nm 以下的結(jié)構(gòu)就看不清了。
我們的超高分辨率顯微鏡采用的是隨機光學重構(gòu)的原理，利用熒光染料在激光的作用下可以出現(xiàn)亮暗態(tài)切換的特性，在某個時間點，一個熒光分子衍射尺度內(nèi)其他分子都是暗的時候，拍照可以把它記錄下來。這些分子的光斑符合高斯分布，通過高斯擬合可以把中心點識別出來。下一個時間點拍照可能是其他分子被記錄下來。由于這些染料的閃爍是隨機不同步的。重復這一過程成千上萬次，就可以把所有的熒光染料記錄下來中心點識別出來。利用這些中心點進行重構(gòu)就得到了突破衍射極限的圖像。這就是隨機光學重構(gòu)（STORM）超高的分辨率顯微鏡的原理。
共聚焦可分為激光掃描共聚焦以及轉(zhuǎn)盤共聚焦，都是只采集聚焦平面的光來提升信噪比。僅靠這種方式不能提升空間分辨率，突破不了衍射極限。有些共聚焦結(jié)合了反卷積技術(shù)，可以提升一倍左右的分辨率，達到 100 多納米，有廠家也把這類共聚焦宣傳為超分辨共聚焦。這個經(jīng)典意義的超高分辨率顯微成像是有差異的。
使用物理鎖定的方式，實時追蹤樣品上的一個基準點的位置，并根據(jù)此移動樣品位置，補償樣品漂移。因為基準點可以在樣品制備之前加入，并且在成像過程中亮度保持穩(wěn)定，所以不會增加樣品制備的復雜性，可以在整個成像過程中保持樣品位置穩(wěn)定在1nm左右。
使用配置中的緩沖液和染料及照明光配合，可以使樣品上標記的熒光染料“閃爍”，使得原始圖像上可以獲得單分子的熒光染料圖像，之后通過單分子定位原理，對每個亮點進行位置擬合，并記錄在超高成像結(jié)果中。單個熒光點的定位精度與拍攝中獲得的熒光點光子數(shù)目有關(guān)系，一般情況下可以將分辨率提升10倍。
針對固定的細胞我們有專用的雙通道和三通道成像緩沖液試劑盒，進行單獨售賣。
樣品最好是染色完成后,及時進行拍照，樣本來不及拍照可以避光保存在4℃，保存時間不超過3天。
由于力顯智能科技的iSTORM產(chǎn)品所具備的20nm超高分辨率、2-3通道同時成像、界面友好、簡單易用、系統(tǒng)穩(wěn)定性好、環(huán)境適應性高等綜合特點和優(yōu)勢，使得它能夠幫助到更多科學家進行衍射極限尺度以下的生物分子組織與相互作用等的尖端科學研究，已為包括香港科技大學、香港大學、中山大學、深圳大學、北京大學醫(yī)學院等在內(nèi)等超過50家科研小組和100位科研人員的科學研究的提供幫助，并獲得了高度認可。
iSTORM技術(shù)采用在特定成像緩沖液中具有光切換特性的有機染料。理論上，與激光器波長兼容的光切換染料均適用。但是，用戶應該嚴格測試染料的光切換特性，例如染料在成像緩沖液中的亮/暗工作周期。每個周期釋放出的光子越多、亮/暗工作周期越低、切換次數(shù)越多的染料越合適。本手冊中提供的樣品制備方案均采用Alexa Fluorò 647 和Alexa Fluorò 750這一對熒光染料，這是目前最適合iSTORM雙通道成像系統(tǒng)的選擇。如果實驗僅需要觀察一個目標（即單通道），Alexa Fluorò 647是首選，因為相比Alexa Fluorò 750，Alexa Fluorò 647 每個切換周期釋放出更多的光子，且具有更短的工作周期。
此外，諸如藍色吸收染料（Atto 488、Alexa 488、Atto 520）、黃色吸收染料Cy3B、紅色吸收染料（Alexa 647、Cy5、Dyomics 654、Atto680）和近紅外吸收Alexa 750等染料也都可以用來超高成像。
對生物結(jié)構(gòu)進行特異性標記可通過免疫染色（直接免疫染色法或間接免疫染色法）且以光切換染料標記，也可以通過多肽或酶體（例如商業(yè)化產(chǎn)品SNAP-tag, CLIP-tag, 等等）標記目標蛋白。
適用于iSTORM系統(tǒng)的二抗已經(jīng)商業(yè)化且已被廣泛使用。用戶也可以考慮對一抗、FAB片段或者納米抗體進行熒光標記，由于熒光分子距離目標蛋白更近，所以蛋白定位相比間接免疫熒光標記法更加準確。
iSTORM超高分辨率顯微鏡主要適用于實驗室、研究所及醫(yī)院的實驗與觀察。樣品廣泛適用于分子細胞生物學、神經(jīng)生物學、免疫學、藥理學等領(lǐng)域內(nèi)固定的細胞、組織、細菌、酵母和病毒的研究，iSTORM活細胞版也可以進行活細胞的相關(guān)成像。
熒光染料被激發(fā)進入發(fā)射態(tài)，之后會進入暗態(tài)（Dark state），在暗態(tài)中它們將與自由氧結(jié)合，進入漂白狀態(tài)。在漂白狀態(tài)下，染料不會再次發(fā)出熒光。如果不讓染料與自由氧結(jié)合，它將無法進入漂白狀態(tài)，一直維持在暗態(tài)。高功率的激發(fā)光可以使染料從暗態(tài)再次進入發(fā)射態(tài)。這種從亮到暗再到亮的狀態(tài)切換看起來就像是染料在“閃爍”一樣。STORM通過隨機的分批“點亮”目標分子來進行超分辨定位。這樣每個活躍的熒光集團都被分辨，它們的圖像與其他分子分開，不重疊。這樣確定了基團的準確位置，多次重復這個過程，每次隨機打開熒光基團的不同亞基，得到圖像，確定每個亞基的位置后，把以上圖像重建成一張超高分辨率圖像。
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