什么是隨機光學(xué)重建顯微鏡STORM？

它有什么應(yīng)用？

高爾基體轉(zhuǎn)運網(wǎng)絡(luò)（TGN）和核內(nèi)體是分泌轉(zhuǎn)運途徑中重要的蛋白質(zhì)分選站。蛋白質(zhì)分選基本上是一個空間分離的過程，但在哺乳動物細胞中，尚未以高分辨率系統(tǒng)地分析構(gòu)成分選機制的蛋白質(zhì)之間的空間關(guān)系。在這里，作者借助STORM成像，表明TGN/內(nèi)涵體定位的貨物銜接子AP-1，GGA2和epsinR，在近核高爾基體區(qū)域形成長度超過250納米的伸長結(jié)構(gòu)。作者的數(shù)據(jù)表明，TGN/內(nèi)涵體定位的貨物銜接子具有明顯的空間關(guān)系?？臻g分離的貨物銜接子GGA2和AP-1分別調(diào)節(jié)Frizzled6和Vangl2的分選，并且空間相關(guān)的貨物銜接子可以協(xié)同調(diào)節(jié)特定的分選過程。

NO.1研究介紹（節(jié)選）

在這里，作者利用隨機光學(xué)重建顯微鏡（STORM）以高分辨率提供參與TGN/內(nèi)體分選過程的蛋白質(zhì)空間分布的更廣泛視圖。STORM成像在同一照相機幀中同時捕獲兩種熒光染料以實現(xiàn)20nm的空間分辨率。作者揭示了貨物銜接子AP-1和GGA2是空間分離的，它們分別介導(dǎo)平面細胞極性蛋白Vangl2和Frizzled6的分選。超分辨率成像研究顯示Frizzled6和Vangl2在空間上與不同的網(wǎng)格蛋白銜接子相關(guān)，提供了差異貨物分選過程的直接觀察。

NO.2研究結(jié)果（節(jié)選）

1.網(wǎng)格蛋白與TGN/內(nèi)體定位的貨物銜接子的空間關(guān)系分析

為了測試STORM是否可以用于比較不同高爾基體定位蛋白之間的空間關(guān)系，作者分析了順式高爾基體標(biāo)記GM 130和反式高爾基體標(biāo)記Golgin-97的定位模式。使用常規(guī)光學(xué)顯微鏡，GM 130的定位模式與Golgin 97的定位模式?jīng)]有明顯區(qū)別（圖1A）,相反，用STORM，作者觀察到GM 130與Golgin-97的明顯分離（圖1B，C）。因此，STORM是揭示不同高爾基體定位蛋白質(zhì)之間空間關(guān)系的可行工具。

（A，B）通過常規(guī)熒光顯微鏡（A）或通過STORM（B）可視化的相同COS7細胞中的順式高爾基體標(biāo)記（GM130）和反式高爾基體標(biāo)記（高爾基體-97）的定位模式。比例尺，500 nm。(C)（B）中所示區(qū)域的放大圖。比例尺，100 nm。(D)STORM技術(shù)揭示了兩種不同熒光染料標(biāo)記的順式高爾基體標(biāo)記物（GM130）在COS7細胞中的定位模式。比例尺，500 nm。(E)（D）中所示區(qū)域的放大圖。比例尺，100 nm。(F)基于從每個實驗組中的一個實驗獲得的四個超分辨率圖像，量化GM130和Golgin-97之間以及Alexa Fluor 750標(biāo)記的GM130和Alexa Fluor 647標(biāo)記的GM130之間的重疊像素百分比（平均值± SD）。* ** p〈0.001，采用雙尾Student t檢驗。超分辨率圖像顯示了所指示蛋白在整個核旁區(qū)域中的定位模式。圖中的每個點代表每個單個細胞的整個近核高爾基區(qū)的數(shù)據(jù)。

使用STORM，作者試圖分析COS7細胞中網(wǎng)格蛋白和貨物銜接子之間的空間關(guān)系。作者選擇了大部分貨物銜接子位于其中的整個近核高爾基區(qū)用于以下超分辨率成像分析。這一分析表明，STORM可以檢測到網(wǎng)格蛋白在囊泡外殼周圍的環(huán)狀定位。

圖2 近核區(qū)貨物銜接子與網(wǎng)格蛋白的空間關(guān)系分析

(A-G用抗網(wǎng)格蛋白重鏈和γ 1-adaptin的抗體共染色COS7細胞。應(yīng)用STORM技術(shù)分析了γ 1-adaptin標(biāo)記的AP-1和網(wǎng)格蛋白重鏈標(biāo)記的網(wǎng)格蛋白在COS7細胞中的二維（A-C）和三維（D-G "）定位模式。（A，D）中指示區(qū)域的放大圖分別顯示在（B，C）和（E-G "）中。(H-K'）.用epsinR-FLAG轉(zhuǎn)染COS7細胞。轉(zhuǎn)染后第1天，細胞用抗γ 1-adaptin抗體和FLAG標(biāo)簽共染色。STORM分析同一COS7細胞中epsinR-FLAG和網(wǎng)格蛋白重鏈的空間定位模式。（H）中指定區(qū)域的放大圖見（I-K "）。(L-O用抗網(wǎng)格蛋白重鏈和GGA2的抗體共染色COS7細胞。STORM技術(shù)分析GGA2和網(wǎng)格蛋白重鏈在同一COS7細胞中的三維定位模式。（L）中指定區(qū)域的放大圖見（M-O "）。(P-R)COS7細胞與抗網(wǎng)格蛋白重鏈和AP3 δ 1的抗體共染色。應(yīng)用STORM分析AP3 δ 1和網(wǎng)格蛋白重鏈標(biāo)記的AP-3在COS7細胞中的二維定位模式。圖P中所示區(qū)域的放大圖顯示在（Q，R）中。(S)基于每個實驗組3次獨立重復(fù)采集的超分辨率圖像，定量與網(wǎng)格蛋白相關(guān)的AP-1、GGA2、AP-3或epsinR斑點組分（平均值± SD，基于≥ 9張超分辨率圖像）。超分辨率圖像顯示了所指示蛋白質(zhì)在整個近核區(qū)域中的定位模式，其中定位了大多數(shù)貨物銜接子。圖中的每個點代表每個單個細胞的整個近核高爾基區(qū)的數(shù)據(jù)。

2.TGN/核內(nèi)體定位的貨物銜接子空間關(guān)系分析

接下來，作者以精細分辨率分析了TGN和內(nèi)體定位的貨物銜接子之間的空間關(guān)系。

AP-1和epsinR的超分辨率成像分析顯示一些epsinR結(jié)構(gòu)與AP-1結(jié)構(gòu)相關(guān)（圖3E-H，和圖3I中的定量）和一些AP-1和epsinR結(jié)構(gòu)彼此分離（圖3E，G）。

圖3 近核區(qū)網(wǎng)格蛋白銜接子的空間關(guān)系分析

(A-D，N-Q）COS 7細胞與γ1-adaptin和δ3-adaptin抗體共染色或與γ1-adaptin和GGA 2抗體共染色。然后使用STORM來可視化AP-1和AP-3的定位（A-D）以及AP-1和GGA 2的定位（N-Q）。(E-H，J-M）。用epsinR-FLAG轉(zhuǎn)染COS 7細胞。轉(zhuǎn)染后第1天，用抗γ1-適應(yīng)素和FLAG標(biāo)簽的抗體（E-H）或抗GGA 2和FLAG標(biāo)簽的抗體（J-M）對細胞進行共染色。然后使用STORM可視化γ1和epsinR-FLAG的定位以及GGA 2和epsinR-FLAG的定位。（A、E、J、N）中指定區(qū)域的放大視圖如（B-D、F-H、K-M、O-Q）所示。顯示了每個面板的比例尺。（I，R）定量與epsinR或AP-3相關(guān)的AP-1斑點百分比（I），定量與epsinR或AP-1相關(guān)的GGA 2斑點百分比（R）（平均值± SD，基于≥7張超分辨率圖像）。***p〈0.001，采用雙尾Student t檢驗。AP-1和AP-3分別用抗γ1和δ3抗體標(biāo)記。超分辨率圖像顯示了所指示蛋白質(zhì)在整個近核區(qū)域中的定位模式，其中定位了大多數(shù)貨物銜接子。圖中的每個點代表每個單個細胞的整個近核高爾基區(qū)的數(shù)據(jù)。定量分析基于從每個實驗組的三次獨立重復(fù)獲得的超分辨率圖像。

3.通過超分辨率成像分析可視化平面細胞極性蛋白Vangl2和Frizzled6在TGN離開時的分選

作者選擇了大部分Vangl2定位的近核區(qū)域用于超分辨率成像分析。STORM成像分析顯示，大多數(shù)Vangl2 Y279A、Y280A點狀結(jié)構(gòu)不與AP-1相鄰（圖4J、U）。接下來作者試圖用STORM觀察這些分選過程。

圖4 Vangl2和Frizzled6在通過STORM退出TGN時的分類可視化

(A-H用HA-Vangl2（wt）轉(zhuǎn)染COS7細胞。轉(zhuǎn)染后第1天，將細胞在20 ℃下孵育2 h，然后在32 ℃下孵育5 min。孵育后，用STORM觀察Vangl2（wt）和AP-1 γ亞基在二維（A-D）和三維（E-H "）的定位。（A）中指示區(qū)域的放大圖見（B-D）。（E）中指示區(qū)域的放大圖見（F-H）。（F-H）的180 °旋轉(zhuǎn)視圖如（F'- H'）所示。顯示了每張圖像的比例尺。(I-K)用HA-Vangl2（wt）或HA-Vangl2 Y279A、Y280A或HA-Frizzled6轉(zhuǎn)染COS7細胞。轉(zhuǎn)染后第1天，將細胞在20 ℃下孵育2 h，然后在32 ℃下孵育5 min。孵育后，用STORM觀察Vangl2（wt）和AP-3 δ亞基（I），Vangl2 Y279A、Y280A和AP-1 γ亞基（J），F(xiàn)rizzled6和AP-1 γ亞基（K）的定位。比例尺，500 nm。(L-Q)COS7細胞用HA-Vangl2（L）或HA-Frizzled6（M-P）轉(zhuǎn)染或用epsinR-FLAG和HA-Frizzled6（Q-T）共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后第1天，將細胞在20 ℃下孵育2 h，然后在32 ℃下孵育5 min。溫育后，使用雙色STORM來顯現(xiàn)Vangl2和GGA2（L）、Frizzled6和GGA2（M-P）或epsinR-FLAG和Frizzled6（Q）的定位。（M，Q）中指示區(qū)域的放大圖如（N-P，R-T）所示。(U)與指定貨物相關(guān)的Vangl2或Frizzled6斑點百分比的定量|適配器（平均值± SD，基于每個實驗組≥ 6張超分辨率圖像）。* * p〈0.01，*** p〈0.001，采用雙尾Student t檢驗。超分辨率圖像顯示了所指示蛋白質(zhì)在整個近核區(qū)域中的定位模式，其中定位了大多數(shù)貨物銜接子。圖中的每個點代表每個單個細胞的整個近核高爾基區(qū)的數(shù)據(jù)。定量分析基于從每個實驗組的三次獨立重復(fù)獲得的超分辨率圖像。(V)所提出的模型顯示AP-1、AP-3、epsinR和GGA2在TGN和內(nèi)體膜上的不同微結(jié)構(gòu)域上組裝成具有不同空間關(guān)系的伸長結(jié)構(gòu)：空間分離的GGA2和AP-1分別調(diào)控Frizzled6和Vangl2的分選;空間相關(guān)的貨物銜接子GGA2和epsinR共同調(diào)節(jié)Frizzled6的分選。

NO.3研究討論（節(jié)選）

STORM超高分辨率成像分析也揭示了AP1結(jié)構(gòu)與GGA2結(jié)構(gòu)在很大程度上是分離的，并且至少存在兩個epsinR群，一個與AP-1相關(guān)，另一個與GGA2相關(guān)（圖4V）.在酵母中，這些觀察結(jié)果表明，從酵母到哺乳動物細胞，貨物銜接子之間的空間關(guān)系是保守的。

總之，STORM超高分辨率成像分析表明，貨物銜接子AP-1、AP-3和GGA 2在TGN或核內(nèi)體的不同出口結(jié)構(gòu)域組裝成大的細長結(jié)構(gòu)，以介導(dǎo)特定貨物分子的分選（圖4V）?？臻g分離的GGA 2和AP-1分別調(diào)節(jié)Frizzled 6和Vangl 2的分選。空間相關(guān)的貨物銜接子GGA 2和epsinR共同調(diào)控Frizzled 6的分選。

在本研究中，研究者主要借助STORM超分辨率顯微鏡來研究高爾基體網(wǎng)絡(luò)和內(nèi)體蛋白質(zhì)分選可視化，目前在國內(nèi)，隨機光學(xué)重建顯微鏡STORM已成功實現(xiàn)商用，有需要STORM成像技術(shù)進行實驗研究的專家老師們，可預(yù)約獲得 iSTORM 超高分辨率顯微成像系統(tǒng)試拍服務(wù)~

關(guān)于我們

About us

寧波力顯智能科技有限公司（IN文末可預(yù)約超高分辨率顯微成像系統(tǒng) iSTORM試拍！VIEW）是專業(yè)從事超高分辨率顯微技術(shù)和產(chǎn)品研發(fā)的科技企業(yè)，依托復(fù)旦大學(xué)的自動控制、新一代信息技術(shù)及香港科技大學(xué)的生物、光學(xué)、圖像處理等的技術(shù)，擁有光學(xué)、生物、自控、機械、信息技術(shù)等多領(lǐng)域交叉學(xué)科技術(shù)團隊，將2014年諾貝爾化學(xué)獎技術(shù)產(chǎn)業(yè)化，推出了超高分辨率顯微成像系統(tǒng)iSTORM、細胞智能監(jiān)控助手賽樂微等一系列產(chǎn)品，幫助人們以前所未有的視角觀察微觀世界，突破極限，見所未見。