隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy，簡稱STORM)，是一種超分辨率顯微鏡，其分辨率比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡高10倍以上。

我們知道，光學(xué)顯微鏡憑借其非接觸、無損傷等優(yōu)點，長期以來是生物醫(yī)學(xué)研究的重要工具。但由于光的衍射限制了光學(xué)顯微鏡的分辨率，傳統(tǒng)的顯微鏡已經(jīng)不適于生命科學(xué)研究中的超微結(jié)構(gòu)成像了。本文將從原理、應(yīng)用等方面對隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM進(jìn)行相關(guān)研究，歡迎各位老師討論交流。

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光的衍射

限制了光學(xué)顯微鏡的分辨率

在了解STORM之前，需要先知悉一個概念。眾所周知，光學(xué)顯微鏡是用可見光來觀察生物樣品的。而光是一種橫波，當(dāng)它經(jīng)過一個圓孔，且這個圓孔的大小與光的波長差別不大時，光在此時不會沿直線傳播，而是在各個方向上“溜走”。光在傳播過程中，遇到障礙物或小孔時，光將偏離直線傳播的路徑而繞到障礙物后面?zhèn)鞑サ默F(xiàn)象，這就叫光的衍射。

由此而形成的圓孔衍射圖樣，叫“艾里斑”（圖1）。正因如此，任何一種顯微鏡系統(tǒng)都無法把光線在像平面匯聚成無限小的點，而是只能形成有限大小的艾里斑。如果兩個點很接近，像平面上的兩個艾里斑就幾乎重合在一起，那物平面上的兩個點就不可分辨了。

圖1、“艾里斑”概念圖

所以，光的衍射使得光學(xué)顯微鏡的分辨率存在著極限(約為200 nm)，使得傳統(tǒng)顯微鏡無法清晰觀察尺寸在200 nm以內(nèi)的生物結(jié)構(gòu),極大制約了生命科學(xué)研究的發(fā)展。

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超分辨率顯微鏡

打破分辨率極限

科研工作者為了看到更精細(xì)的生命體精細(xì)結(jié)構(gòu)，就要想辦法突破這一成像障礙。為此，多種超分辨率顯微鏡被開發(fā)了出來（超越了光學(xué)顯微鏡的分辨率極限，故被稱為超分辨顯微鏡）。在這里，我們集中討論其中這樣一個具有相對優(yōu)勢的顯微鏡：隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM。

在2006年的Nature上，莊小威與其它同事發(fā)現(xiàn)了一種能夠數(shù)百次反復(fù)在各種顏色的光照下使用且可在熒光態(tài)和暗態(tài)轉(zhuǎn)化的發(fā)光分子團(tuán)，從而得到了一種比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡高10倍以上分辨率的顯微技術(shù)，并將其命名為隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡，簡稱STORM。

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隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM

技術(shù)原理簡介

正如前面提到的那樣，兩個挨得很近的光點會讓我們分辨不出誰是誰，那么如果我們分開來看呢？

也就是說，當(dāng)我們照射并觀察第一個點時，第二個點并不會發(fā)光，自然不會產(chǎn)生艾里斑影響我們觀察第一個點，前者艾里斑的中心點位置就是熒光分子的準(zhǔn)確位置。接下來，通過某種方法，讓第二個點被照亮。這個時候第一個點又不在光斑的照明范圍之內(nèi)了，同樣不會干擾對第二個點的觀察。通過這種“以時間換空間”的設(shè)計，巧妙地繞開了阿貝極限（顯微鏡分辨極限）的束縛，將光學(xué)顯微鏡的分辨率大大提高。

STORM技術(shù)就運(yùn)用了這種思想，它使用的是有機(jī)熒光分子對染料，并且通過一些方法使細(xì)胞內(nèi)的一小部分熒光分子發(fā)光，而不是全部。這樣由于發(fā)光的點分布比較分散，重疊比較少，因此每個光暈可以近似為一個熒光分子。在一次激發(fā)中，可以確定一部分光暈的中心，在下一次激發(fā)中，可以確定另外一部分光暈的中心，把這許多次激發(fā)的結(jié)果疊加，就是完整而清晰的圖像。

STROM成像過程包含一系列圖像循環(huán)。每個循環(huán)中，只打開視野下一部分熒光基團(tuán)，這樣每個活躍的熒光集團(tuán)都被分辨，它們的圖像與其他分子分開，不重疊。這樣確定了基團(tuán)的準(zhǔn)確位置，多次重復(fù)這個過程，每次隨機(jī)打開熒光基團(tuán)的不同亞基，得到圖像，確定每個亞基的位置后，把以上圖像重建成清晰的整個圖像。理論上STORM可得到分辨率達(dá)到幾個納米的熒光圖像。

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隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM

技術(shù)應(yīng)用案例

隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(STORM)是一種超分辨率顯微技術(shù)，能夠在二維或三維、多種顏色下成像，甚至可以對活細(xì)胞成像。這種成像技術(shù)的方法根據(jù)正在成像的內(nèi)容、如何成像以及正在產(chǎn)生的圖像類型而變化很大，可以應(yīng)用于生命科學(xué)的許多領(lǐng)域，并為從神經(jīng)科學(xué)到亞細(xì)胞科學(xué)的許多不同需求提供非常高分辨率的圖像。自STORM技術(shù)被提起以來，越來越多的研究人員認(rèn)識到了這項技術(shù)的優(yōu)勢并廣泛運(yùn)用于研究中。

（以近些年的部分研究成果為例）

2013年，cell 雜志上的一篇研究報告：莊小威團(tuán)隊利用超分辨率熒光成像方法（STORM）對端粒 DNA 進(jìn)行原位成像，直接可視化染色質(zhì)中的 T 環(huán)結(jié)構(gòu)，并系統(tǒng)地評估保護(hù)蛋白在 T 環(huán)形成中的作用。（點此查看原文）

圖3、STORM 成像顯示染色質(zhì)擴(kuò)散后的 T 環(huán)

2017年，Liu Riyue團(tuán)隊開發(fā)了一種光漂白的方法，以有效地降低藍(lán)藻和植物細(xì)胞的自身熒光并利用STORM技術(shù)在球形藍(lán)藻原綠球菌和開花植物擬南芥中獲得了~10nm的橫向分辨率。（點此查看原文）

圖4、雙Z環(huán)的STORM圖像

2018年，Lin, Danying團(tuán)隊提出了一種在固定樣本上采用Refresh熒光探針的方法，擴(kuò)展了多層 3D STORM的成像深度，并顯示了COS-7 細(xì)胞中微管、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的三通道、擴(kuò)展深度 3D prSTORM圖像。（點此查看原文）

圖5、 COS-7 細(xì)胞中微管、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的三通道、擴(kuò)展深度 3D prSTORM 圖像

2019，Schlegel J ,  Peters S ,  Doose S 團(tuán)隊通過直接隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（dSTORM）進(jìn)行超分辨率顯微鏡觀察，顯示腦膜炎球菌周圍有GM1聚集，突出了其對細(xì)菌侵襲的重要意義。（點此查看原文）

圖6、表達(dá)GFP的腦膜炎球菌（綠色）的GM1和Gb3的dSTORM圖像

2021，Hazime, K.S., Zhou, Z., Joachimiak團(tuán)隊運(yùn)用STORM技術(shù)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)IFT融合蛋白的細(xì)胞在纖毛基部，IFT亞基位于九個不同的位點，在它們進(jìn)入纖毛干之前，IFT蛋白以高親和力停靠在纖毛基部的9個位點。（點此查看原文）

色）的GM1和Gb3的dSTORM圖像

2021，Hazime, K.S., Zhou, Z., Joachimiak團(tuán)隊運(yùn)用STORM技術(shù)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)IFT融合蛋白的細(xì)胞在纖毛基部，IFT亞基位于九個不同的位點，在它們進(jìn)入纖毛干之前，IFT蛋白以高親和力?？吭诶w毛基部的9個位點。（點此查看原文）

圖7、IFT顆粒蛋白的定位，N-或C-末端3HA標(biāo)記的IFT蛋白、KIN1/KIF3A驅(qū)動蛋白和銜接蛋白ODA16的頂視圖和側(cè)（側(cè)）視圖的STORM圖像。

2021，Blandin, Anne-Florence團(tuán)隊利用球狀體膠質(zhì)瘤細(xì)胞擴(kuò)散的體外模型，發(fā)現(xiàn)α5整合素缺失的細(xì)胞比表達(dá)α5的細(xì)胞對TKIs更敏感。（點此查看原文）

圖8、吉非替尼處理的細(xì)胞的雙色dSTORM圖像顯示細(xì)胞外周和核內(nèi)體上的EGFR/β1整合素復(fù)合體

STORM因為其優(yōu)異的單分子成像能力，越來越多的被用在細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)的探索。對STORM的更多研究將提供更有效的方法來制備樣品和成像樣品，以及提供更高分辨率的圖像。相信在未來這項技術(shù)能得到進(jìn)一步發(fā)展，變成功能更為強(qiáng)大的利器。