傳統(tǒng)熒光顯微鏡的分辨率限制阻礙了病毒蛋白的可視化，因為任何單個熒光信號的尺寸通常大于大多數(shù)病毒粒子。超分辨率顯微鏡有可能在接近電子顯微鏡的分辨率下揭示蛋白質(zhì)的分布，而不依賴于EM中所需的生物標(biāo)本的現(xiàn)有特征的形態(tài)特征。
人類免疫缺陷病毒1型 (HIV-1) 近似球形，平均直徑為125 ± 14 nm 。它的主要結(jié)構(gòu)成分是含有包膜糖蛋白的脂質(zhì)雙層，位于病毒脂質(zhì)膜下方的基質(zhì)殼和具有錐形幾何形狀的衣殼核心。HIV-1蛋白的熒光標(biāo)記為它們在感染細胞中的亞細胞定位提供了有價值的見解。然而，由于病毒顆粒小于常規(guī)熒光顯微鏡的分辨率極限，因此難以檢測細胞進入和復(fù)制的分子機制。 電子顯微鏡技術(shù)提供了結(jié)構(gòu)對HIV-1的見解,但在技術(shù)上仍然要求很高，并且容易引入人工制品。該技術(shù)在感染過程中具有可視化病毒蛋白分子組織的巨大潛力，尤其是在用熒光蛋白標(biāo)記會損害病毒感染性的情況下。以前的研究已經(jīng)使用超分辨率技術(shù)來可視化人工轉(zhuǎn)染到細胞系中的病毒蛋白簇。在這項研究中，作者使用dSTORM提供了真正感染淋巴樣細胞之前和之后感染性HIV-1顆粒中基質(zhì)和衣殼蛋白的分子分布之一。
作者使用dSTORM可視化無細胞HIV-1病毒體和感染的淋巴樣細胞中的基質(zhì)和衣殼蛋白。首先產(chǎn)生了包含綠色熒光蛋白-病毒蛋白R融合蛋白 (hivgfp-vpr) 的HIV-1顆粒，這使作者能夠用常規(guī)熒光顯微鏡觀察顆粒。然后將相同的病毒體制劑均勻地涂在玻璃蓋玻片上或用于感染淋巴細胞。重要的是，在允許病毒進入靶細胞20分鐘后，通過鏈蛋白酶處理從靶細胞表面去除非內(nèi)化的病毒顆粒。這通過將靶細胞與包膜缺陷型HIV-1孵育得到證實，所述包膜缺陷型細胞不能進入靶細胞，因此被鏈霉蛋白酶切割，因此在這些樣品中不能檢測到病毒蛋白 (圖1)。
圖1 鏈蛋白酶處理從細胞表面去除非內(nèi)化的病毒顆粒
MT-2細胞在17 °C下用 (a，c) HIVGFP-Vpror (b，d) HIVΔenvGFP-Vpr感染2小時，以使病毒體與細胞結(jié)合。之后，將細胞洗滌以除去未結(jié)合的病毒顆粒，并在37 °C下孵育20分鐘，以使病毒進入細胞。然后將樣品分開，將一半的細胞與PBS (a-b) 孵育，而另一半用鏈蛋白酶 (c-d) 處理以去除非內(nèi)在化的病毒顆粒。隨后，通過寬視場顯微鏡，然后進行反卷積，對所有樣品進行固定，反染色，安裝和可視化。GFP以綠色顯示，核以藍色顯示。所提供的圖像是從以0.3 μ m步長拍攝的28個圖像的z堆疊的體積壓縮得出的。
因此，與淋巴細胞相關(guān)的所有基質(zhì)和衣殼蛋白簇均被內(nèi)化。通過細胞因子離心將感染的細胞固定并鋪在玻璃蓋玻片上。兩個樣本都是用識別基質(zhì)或caspid蛋白的抗體免疫染色。作者首先將傳統(tǒng)圖像與超分辨率圖像進行了比較。在TIRF圖像中，感染的t淋巴細胞中的HIV-1蛋白表現(xiàn)為明亮的點狀結(jié)構(gòu) (圖2a)。在dSTORM中，熒光團的隨機激活可以分析單個蛋白質(zhì)的點擴散功能 (PSF)。
dSTORM揭示了同一蛋白的分布比TIRF圖像中更大的異質(zhì)性 (圖2b)。通過dSTORM中蛋白質(zhì)簇的兩個圖像的疊加來說明使用dSTORM實現(xiàn)的分辨率的提高。
圖2 進入淋巴細胞之前和之后感染HIV-1的單個分子的超分辨率成像
(a-c) 常規(guī)全內(nèi)反射熒光 (TIRF) 圖像 (a) 、相應(yīng)的dSTORM圖像 (b) 和HIV-1基質(zhì)蛋白在同步進入淋巴細胞系MT-2 20分鐘后的TIRF (白色) 和dSTORM (紅色) 圖像 (c) 的疊加。(d) dSTORM定位的分子坐標(biāo)的定位精度值的直方圖，對應(yīng)于a-c中所示的數(shù)據(jù)集。定位精度對應(yīng)于擬合到單個分子的點擴展函數(shù)的高斯分布的一個西格瑪，并且還受光子和噪聲水平的影響。虛線表示平均值。(e-h) 基于Ripley K函數(shù)對無細胞病毒體中的基質(zhì)蛋白進行聚類分析，將分子坐標(biāo) (e) 的點分布轉(zhuǎn)換為聚類圖，該聚類圖具有高度到較少的聚類區(qū)域，顏色為紅色到藍色 (f)。從閾值圖像 (g) 中提取聚類統(tǒng)計信息，例如數(shù)量，大小和相關(guān)分子。通過將gfp-vpr (綠色) 的TIRF圖像與二元簇圖疊加，定量了細胞進入后病毒蛋白與逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的關(guān)聯(lián) (h)。比例尺，a-b中板為5μm; c中板為1μm，e-h中板為2μm。(i) 定量分析無細胞病毒粒子中衣殼蛋白分子簇的直徑，并在感染入MT-2細胞后20分鐘。誤差條表示來自兩個實驗的代表的每個樣本26-173個簇的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
這種單分子成像方法使作者能夠在感染過程中跟蹤基質(zhì)殼和衣殼核心的重組，這可能反映了促進HIV-1逆轉(zhuǎn)錄過程的結(jié)構(gòu)重排，例如病毒體的未包被。
作者能夠通過dSTORM量化HIV-1基質(zhì)殼和衣殼核心的大小，這些結(jié)果與EM所見的已知HIV組織一致。此外，該方法提供了新的信息，表明當(dāng)細胞進入時，與無細胞HIV-1病毒體相比，病毒體基質(zhì)殼和衣殼核心的大小顯著增加，這表明HIV顆粒在進入靶細胞后立即經(jīng)歷了顯著的重排。
總之，這項研究驗證了使用dSTORM評估傳染性病毒生命周期中病毒蛋白的分子分布，并為在早期階段研究病毒蛋白的分布和重新分布開辟了新的可能性病毒感染。
