01研究背景
端粒是位于染色體末端的保護(hù)性結(jié)構(gòu)，是在哺乳動(dòng)物中由(TTAGGG)n和相關(guān)蛋白的混合物組成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列。端粒在許多細(xì)胞過程中起著保護(hù)染色體免受降解、激活復(fù)制衰老和調(diào)節(jié)基因表達(dá)等重要作用。
在體細(xì)胞中，端粒脫保護(hù)觸發(fā)DNA損傷反應(yīng)和端粒介導(dǎo)的復(fù)制性衰老，可以被視為阻止正常老化細(xì)胞增殖的內(nèi)在過程。端粒也會(huì)導(dǎo)致干細(xì)胞的耗竭和健康細(xì)胞更新的喪失、組織再生缺陷、組織功能下降、衰老細(xì)胞積累等。而衰老細(xì)胞在組織中的積聚被認(rèn)為是長(zhǎng)期慢性炎癥和與年齡相關(guān)的疾病（包括癌癥）的主要原因。生物年齡是許多慢性疾病發(fā)病率的主要預(yù)測(cè)因素。在正常細(xì)胞衰老過程中，端粒完整性的喪失也會(huì)引發(fā)DNA損傷信號(hào)，最終導(dǎo)致衰老表型。
熒光顯微鏡有助于研究人員研究端粒的動(dòng)力學(xué)、形狀、定位和蛋白質(zhì)的共分布。研究這些結(jié)構(gòu)的顯微鏡工具目前已發(fā)展到能夠?qū)τ绊懚肆５姆肿訖C(jī)制進(jìn)行探究。作者以人類成纖維細(xì)胞為例，利用多種顯微鏡，以及兩種超分辨率技術(shù)，即三維結(jié)構(gòu)照明顯微鏡(3D-SIM)和直接隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（dSTORM）來研究端粒的幾個(gè)特征。在本文中，重點(diǎn)介紹直接隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（dSTORM）對(duì)于端粒研究的益處。
02研究介紹（節(jié)選）
一、端粒可視化
深入了解維持端粒完整性所涉及的途徑和蛋白質(zhì)，對(duì)于提高細(xì)胞壽命和延緩年齡相關(guān)疾病發(fā)病至關(guān)重要。大約25年前，端粒DNA首次被熒光顯微鏡觀察到，只是那時(shí)候顯微技術(shù)的分辨率還有待提高。大約150年前，恩斯特·阿貝首先描述了分辨率極限，它被定義為兩個(gè)物體之間的最短距離（在這個(gè)距離上，它們可以被區(qū)分為兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)體）。對(duì)于遠(yuǎn)場(chǎng)熒光顯微鏡，光學(xué)分辨率由光波長(zhǎng)和物鏡的數(shù)值孔徑?jīng)Q定。
此外，細(xì)胞特征和背景之間的反差會(huì)降低圖像的分辨率，要求研究人員使用明亮的探針。雖然在熒光顯微鏡中，樣品中的對(duì)比度通常不是唯一因素，但分辨率在物理上受到光的衍射的限制，其橫向(X，Y)分辨率為200-250納米，軸向(Z)分辨率為500-700納米。為了突破衍射極限，需要在橫向、軸向或兩者同時(shí)提高兩倍或更多的分辨率，目前已經(jīng)開發(fā)了各種技術(shù)。
可視化、分析和定量單個(gè)端粒的首選技術(shù)之一是將端粒上發(fā)現(xiàn)的TTAGGG序列與熒光標(biāo)記肽核酸(PNA)探針直接雜交。這種被稱為熒光原位雜交(FISH)的技術(shù)，可以用來測(cè)定中期擴(kuò)散的端粒長(zhǎng)度，因?yàn)楦嗟拇?lián)端粒序列（即更長(zhǎng)的端粒）允許更多的PNA分子結(jié)合，因此可以看到更亮的“斑點(diǎn)”。為了說明FISH的應(yīng)用，作者對(duì)衰老前成纖維細(xì)胞進(jìn)行中期擴(kuò)散，并用Alexa Fluor488結(jié)合PNA探針染色端粒DNA。
圖1、衰老成纖維細(xì)胞端粒熒光原位雜交、BJ成纖維細(xì)胞染色體畸變的圖像。
（A）一個(gè)有46條染色體的衰老前期BJ細(xì)胞的中期擴(kuò)散，DNA用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚/DAPI（藍(lán)色）和端粒用PNA Telc-488探針（綠色）染色。
（B）白色箭頭代表脆弱的端粒或端粒二重體
（C）姐妹端粒丟失導(dǎo)致短端粒
（D）姐妹染色單體上的無信號(hào)端
（E）間質(zhì)端粒序列和姐妹端粒丟失導(dǎo)致一個(gè)無信號(hào)端。
作者觀察了預(yù)期的46條染色體，大多數(shù)染色體末端含有可檢測(cè)到的端粒染色。將FISH應(yīng)用于中期擴(kuò)散對(duì)于確定染色體畸變（包括含有無信號(hào)末端的染色體）是很重要的。在這種情況下，端粒太短則不能被PNA探針識(shí)別，熒光信號(hào)太暗則不能在圖像采集期間被檢測(cè)器讀取。對(duì)無信號(hào)末端的存在，可以進(jìn)行估計(jì)，可估計(jì)有多少極短的染色體或可能沒有端粒DNA。
SIM和STED可以通過控制照明光來提高分辨率，SMLM技術(shù)只記錄每張圖像中熒光團(tuán)總數(shù)的稀疏子集，以實(shí)現(xiàn)20-50納米的成像分辨率。即使成像分子表現(xiàn)為衍射限制點(diǎn)，只要它們彼此相距至少200納米就可以通過擬合和質(zhì)心查找來確定它們的準(zhǔn)確定位。超分辨率顯微鏡和優(yōu)化的成像技術(shù)顯著提高了對(duì)端粒生物學(xué)的理解。由于端粒在間期細(xì)胞內(nèi)的半徑低于衍射限制分辨率，通常為60-100納米，因此利用超分辨率技術(shù)來研究端粒的大小和形狀越來越受到人們的關(guān)注。
二、構(gòu)建端粒形狀
直接隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（dSTORM）通過熒光染料的“閃爍”操作，利用單個(gè)熒光團(tuán)的時(shí)間分離來工作，即在任何一個(gè)時(shí)間只記錄來自稀疏的單個(gè)熒光團(tuán)集的發(fā)射，再經(jīng)過擬合和質(zhì)心查找，將獲取的圖像序列轉(zhuǎn)換為高分辨率圖像。通常是使用Alexa Fluor647（Thermo Fisher Scientificial），意味著單個(gè)Alexa Fluor647分子經(jīng)歷了開-關(guān)（亮-暗）循環(huán)，在每次采集視場(chǎng)中只有約1%的熒光團(tuán)發(fā)射光，利用Alexa Fluor647共軛PNA探針染色，將樣品浸入氧清除緩沖液中以促進(jìn)光開關(guān)并多次循環(huán)重復(fù)，獲取時(shí)間序列后，利用高斯擬合可以重建超分辨率圖像，以此來實(shí)現(xiàn)20-30納米的橫向分辨率。
超分辨率技術(shù)dSTORM最初被用于可視化來自不同類型細(xì)胞的端粒的非環(huán)結(jié)構(gòu)。早期的電子顯微鏡顯示，端粒DNA的物理末端會(huì)折疊并置換一條DNA鏈，形成所謂的T環(huán)結(jié)構(gòu)。另外的研究表明，這種重要的結(jié)構(gòu)在特定的防護(hù)蛋白缺失時(shí)會(huì)丟失，導(dǎo)致DNA損傷反應(yīng)的激活。這些研究表明，dSTORM是一種非常強(qiáng)大的技術(shù)，可以準(zhǔn)確地顯示T環(huán)的結(jié)構(gòu)。
作者計(jì)算、重構(gòu)和可視化了dSTORM的數(shù)據(jù)，在分析點(diǎn)云的單個(gè)大小和形狀時(shí)，發(fā)現(xiàn)端粒是極其不均勻的，并不總是以球形結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。例如，它們可能在一個(gè)維度上被拉長(zhǎng)，形成一個(gè)更橢圓形或矩形的形狀，或者非常不規(guī)則。當(dāng)對(duì)BJ細(xì)胞中的單個(gè)點(diǎn)云進(jìn)行三維可視化時(shí)，作者還觀察到了各種不同的形狀。當(dāng)觀察到球形端粒，作者經(jīng)常發(fā)現(xiàn)不規(guī)則的異構(gòu)結(jié)構(gòu)，這為端粒區(qū)域的性質(zhì)提供線索。這些圖像顯示了BJ成纖維細(xì)胞端粒DNA的不同三維排列，證實(shí)了3D-STORM是研究端粒形狀的合適技術(shù)。
圖2、3D-STORM測(cè)定端粒形狀的變異性。
（A)一個(gè)二維寬視場(chǎng)快照的例子，一個(gè)表示3D的像散寬視場(chǎng)快照，重構(gòu)3D- STORM數(shù)據(jù)的最大強(qiáng)度投影，以及PNA TelC-647探針染色的BJ成纖維細(xì)胞的覆蓋圖像。比例尺=5 μm。
（B) NEO SAFe軟件中單個(gè)本地化的可視化。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)分子，使用DBSCAN將它們分組成簇。不同的顏色代表z位置。
比例尺= 4 μm，其中紅色= x軸，綠色= y軸，藍(lán)色= z軸。識(shí)別出各種不同的形狀，包括球形(C)、不規(guī)則(D)和橋狀結(jié)構(gòu)(E)。標(biāo)尺桿= 50 nm，其中紅色= x軸，綠色= y軸，藍(lán)色= z軸。
三、測(cè)量端粒大小
由于3D-STORM的橫向分辨率為20-30納米，軸向分辨率為50-70納米，因此可以用來測(cè)量端粒大小。根據(jù)SMLM成像，端粒大小的一個(gè)常見讀數(shù)是回轉(zhuǎn)半徑，即每個(gè)單個(gè)分子到分子云質(zhì)心位置（質(zhì)心）的均方根距離。然而，由分子云的最外層點(diǎn)確定的端粒體積也可以作為尺寸的讀出值。利用這些測(cè)量，研究小組試圖計(jì)算端粒密度或壓實(shí)，它代表一定體積內(nèi)端粒DNA的數(shù)量，以探索端粒DNA是如何包裝的。然而，Alexa Fluor647的光開關(guān)特性使得在dSTORM采集過程中，一個(gè)Alexa Fluor647分子可以被多次檢測(cè)。因此，雖然短端粒平均來說比長(zhǎng)端粒有更少的開關(guān)周期，長(zhǎng)端粒含有更多的PNA探針，但一個(gè)定位并不等于一個(gè)Alexa Fluor647分子。這使得很難根據(jù)定位的數(shù)量和大小來提取密度測(cè)量值。一種可能是根據(jù)每個(gè)端粒焦點(diǎn)的定位數(shù)量來繪制體積，放松會(huì)導(dǎo)致更垂直的繪制線路。然而，如果PNA探針雜交受到端粒致密狀態(tài)的影響，其密度可能被低估。另一個(gè)需要注意的特點(diǎn)是3D-STORM有一個(gè)有限的Z深度，通常在800-1000納米左右。因此，為了覆蓋整個(gè)核，需要在多個(gè)焦平面上進(jìn)行三維STORM成像，并進(jìn)行折射率校正。盡管勞動(dòng)強(qiáng)度很大，這項(xiàng)技術(shù)揭示了線粒體和微管之間的新的相互作用，并可能對(duì)端粒與核膜的相互作用提供更多的見解。它對(duì)于T環(huán)的可視化和單個(gè)短端粒的尺寸測(cè)量非常強(qiáng)大，超出了3D-SIM所能實(shí)現(xiàn)的范圍。
圖3、通過不同的方法，將端粒的大小與寬視場(chǎng)、3D-SIM和dSTORM顯微鏡技術(shù)所能分辨的最小體積進(jìn)行比較。
03超高分辨顯微成像系統(tǒng)iSTORM
傳統(tǒng)的顯微鏡技術(shù)使了解端粒生物學(xué)基礎(chǔ)成為可能，但端粒的納米級(jí)研究還確實(shí)需要隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM等超分辨率顯微鏡。目前，在國(guó)內(nèi)，隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM已成功實(shí)現(xiàn)商用。現(xiàn)已發(fā)布的超高分辨率顯微成像系統(tǒng) iSTORM，成功實(shí)現(xiàn)了光學(xué)顯微鏡對(duì)衍射極限的突破，使得在 20納米的分辨率尺度上從事生物大分子的單分子定位與計(jì)數(shù)、亞細(xì)胞及超分子結(jié)構(gòu)解析、生物大分子生物動(dòng)力學(xué)等的研究成為現(xiàn)實(shí)，從而給生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域帶來重大突破 。
超高分辨率顯微成像系統(tǒng) iSTORM 具有 20 納米超高分辨率、3通道同時(shí)成像、3D同步拍攝、實(shí)時(shí)重構(gòu)、2小時(shí)新手掌握 等特點(diǎn)，并提供熒光染料選擇、樣本制備、成像服務(wù)與實(shí)驗(yàn)方案整體解決方案， 以納米級(jí)觀測(cè)精度、高穩(wěn)定性、廣泛環(huán)境適用、快速成像、簡(jiǎn)易操作等優(yōu)異特性，獲得高度認(rèn)可！
參考文獻(xiàn)
Adam N, Beattie TL, Riabowol K. Fluorescence microscopy methods for examining telomeres during cell aging. Ageing Res Rev. 2021 Jul;68:101320. doi: 10.1016/j.arr.2021.101320. Epub 2021 Mar 17. PMID: 33744488.
