01摘要
纖毛的基部由過渡區 (TZ) 和過渡纖維 (TF) 組成，可以作為選擇門來調節鞭毛內 (IFT) 的蛋白質的運輸。在進入纖毛腔之前，IFT 復合物和運輸的物質在纖毛基部或附近積聚。纖毛基部 IFT 蛋白的空間組織是了解纖毛形成和功能的關鍵。使用隨機光學重建顯微鏡 (STORM) 和計算平均，作者發現 7 個 TZ、9 個 IFT、3 個 Bardet-Biedl 綜合征 (BBS) 和一個中心體蛋白在纖毛四膜蟲的纖毛基部形成 9 個簇狀環。在軸向維度上，所研究的 TZ 蛋白定位于約 30 nm 的狹窄區域，而 IFT 蛋白停靠在 TZ 附近約 80 nm 處。此外，IFT-A 亞群位于 IFT-B 亞群的外圍，所研究的 BBS 蛋白位于睫狀膜附近。選定蛋白質的 HA 標記的 N 和 C 末端的定位能夠預測蛋白質顆粒的空間方向和可能的物質相互作用位點。基于獲得的數據，作者建立了一個全面的 3D 模型，顯示了所研究的睫狀蛋白的排列。
02研究介紹（節選）
纖毛是基于微管的指狀細胞突起。纖毛從基底體中出現，這些基底體是將纖毛錨定并定位在細胞表面內的中心同源結構。過渡區 (TZ)具有獨特的超微結構和蛋白質組成。TZ的特征是Y形連接，即將軸突的微管雙峰連接到睫狀膜的Y形結構。TZ的生化和遺傳分析揭示了TZ蛋白之間的相互作用關系。
最近出現的幾種超分辨率成像工具，適用于探查蛋白質排列和分布的細微差異，能夠對一些 TZ 、IFT和TF蛋白質進行詳細分析。但是，目前尚不清楚 IFT 和 BBS 蛋白在進入纖毛之前究竟在哪里形成顆粒并停靠。這個問題的答案對探究 IFT/BBS 如何在纖毛基部進行調節以控制纖毛的形成和功能，以及它如何受到疾病相關而產生突變至關重要。
在這里，作者研究了纖毛蟲嗜熱四膜蟲纖毛基部的 TZ、IFT 和 BBS 蛋白的空間組織。在橫向（側面）和頂部視圖中可以看到，這種單細胞真核生物擁有數百個纖毛。單個細胞內大量的相同結構有助于提高超分辨率圖像的定位精度并實現多維重建。使用隨機光學重建顯微鏡 (STORM) 和計算平均，作者估計了 30 多個表位標簽的徑向和軸向位置，這些表位標簽與睫狀體 TZ 的七個成分、IFT 粒子的九個成分、BBSome 的三個成分和一個直系同源物融合在一起。 總之，作者生成了一個全面的 3D 模型，分辨率為 15-30 nm，顯示了幾個 TZ、IFT 和 BBS 蛋白質在這種情況下導致的 IFT 復合體的結構變化和纖毛運輸的損傷。
03研究結果（節選）
1、四膜蟲TZ 蛋白的空間組織
TZ 蛋白在進化中非常保守。因此，在簡單的模式生物（如纖毛四膜蟲嗜熱菌）中進行的分析有助于理解纖毛蛋白的定位和功能。為此，作者使用 STORM 顯微鏡來揭示選定四膜蟲的定位TZ 蛋白并將它們在 TZ 區域內的空間組織與哺乳動物運動纖毛和初級纖毛中描述的 TZ 蛋白的排列進行比較。
圖1、 過渡區蛋白的定位。
當使用 STORM 對HA 標記的 TZ 蛋白成像時，它們主要表現為 9 簇環（圖 1 B，B'，C-H）。這些環的半徑對應于抗原（與蛋白質融合的標簽）和纖毛中心之間的距離（圖 2 A''）。基于分析表位的間接與直接檢測的測量值相差 1-11 nm（圖 1 M）。這與 12 nm的抗體大小一致并提供了一種評估抗體標記引入的連鎖錯誤的大小和方向的方法
STORM 成像顯示，四膜蟲TMEM216 在所有研究的 TZ 蛋白中形成最大的環，半徑為 164 ± 5 nm（圖 1 C，M）。四膜蟲的 30 個氨基酸 C 末端TMEM231 位于半徑 149 ± 6 nm 處，距 TMEM216-C 末端約 15 nm（圖 1 F，M）。
2、STORM 成像顯示 IFT 顆粒停靠在睫狀體基部
在前往纖毛之前，IFT 蛋白集中在纖毛的基部。為了在進入纖毛之前可視化 IFT 顆粒并估計它們的對接位點，作者設計了表達 N 或 C 末端 3HA 標記的 IFT 蛋白的四膜蟲細胞。此外，作者分析了 ODA16、IFT 物質銜接蛋白和 KIN1、KIF3a 的四膜蟲直系同源物。
圖2、IFT顆粒蛋白的定位，N-或C-末端3HA標記的IFT蛋白、KIN1/KIF3A驅動蛋白和銜接蛋白ODA16的頂視圖和側（側）視圖的STORM圖像。
共聚焦成像顯示，在全長纖毛中，IFT 蛋白主要在纖毛基部/基體和纖毛尖端被檢測到，而IFT52、IFT57、IFT80、IFT122 和IFT172 沿著纖毛長度的 IFT 信號是無法檢測到的，這可能是由于全長纖毛中 IFT 粒子的濃度非常低。而STORM 成像顯示，表達 IFT 融合蛋白的細胞在纖毛基部，IFT 亞基位于九個不同的位點，作者將其稱為“對接位點”（圖 2 A-G）。這些觀察表明，在它們進入纖毛干之前，IFT 蛋白以高親和力停靠在纖毛基部的 9 個位點。
3、BBS 蛋白定位于纖毛基部的纖毛膜附近
纖毛跨膜蛋白的轉運依賴于 BBSome，這是一種與 IFT 轉運密切相關的復合物。IFT27是 IFT-B 子復合體的一個組成部分，用作錨定點，BBSome 在其上連接到IFT粒子。為了闡明纖毛基部 IFT 和 BBS 復合物之間的空間關系，作者將表達 BBSome 核心蛋白的四膜蟲細胞設計為與 BBS1 和 BBS5 的 N 端或 BBS9 的 N 端和 C 端連接的 3HA 標簽的融合體。
圖3、 BBSome、OFD1 和選定的攜帶導致人類纖毛病的突變的 TZ 和 IFT 蛋白的定位。
STORM 成像顯示，這些表位在徑向和軸向上位于 IFT 復合物 A 蛋白附近，位于 IFT 顆粒的外表面（圖 3 D-I），這與它們在與跨膜蛋白相互作用中的作用一致。作者還發現纖毛基部的 BBS 蛋白模式不像 IFT 蛋白那樣規則，更難以可視化。據推測，這是由于 BBSome 與 IFT 粒子的結合不太穩定，或者是因為 BBSome 的豐度低于 IFT 粒子的豐度，如先前的定量蛋白質組學研究所示。
（更多研究解讀將于后續分享）
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參考文獻：
Hazime, K.S., Zhou, Z., Joachimiak, E. et al. STORM imaging reveals the spatial arrangement of transition zone components and IFT particles at the ciliary base in Tetrahymena. Sci Rep 11, 7899 (2021).
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