慢性腎臟疾病影響著世界上10%以上的人口，其中大多數(shù)源于腎小球的損傷。腎小球過濾屏障（GFB）是一種能夠在血流和尿液之間選擇性滲透的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。 作為GFB組成部分之一的腎小球基底膜（GBM），是腎小球超濾的重要介質(zhì)，它由內(nèi)皮細(xì)胞和其兩側(cè)足細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白組成。 一旦GFB中的任何組成部分出現(xiàn)損傷或遺傳缺陷都將會(huì)導(dǎo)致腎小球過濾屏障功能障礙，從而使得尿液中蛋白質(zhì)含量升高引發(fā)腎臟疾病。
01研究介紹
Suleiman等人通過結(jié)合來自亞衍射分辨率隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM）和電子顯微鏡（EM）的數(shù)據(jù)，表明小鼠和人的腎小球基底膜中蛋白質(zhì)排列相似，形成了獨(dú)特的分層結(jié)構(gòu)，這表明基底膜組織在腎功能中起著關(guān)鍵作用。
同時(shí)，該研究揭示了細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的超微結(jié)構(gòu)，通過對(duì)小鼠和人GBM中聚集蛋白、層粘連蛋白和膠原蛋白IV的N-末端和C-末端附近結(jié)構(gòu)域的單獨(dú)分析，揭示了高度定向的大分子組織。除此之外，這項(xiàng)工作還提供了一種研究不同類型組織中基底膜結(jié)構(gòu)的方法，首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜ECM組織的納米級(jí)觀測(cè)。
02研究結(jié)果
1、用STORM和STORM/Deep-Etch電子顯微鏡對(duì)比成像腎小球?yàn)V過屏障的超微結(jié)構(gòu)
為了揭示 GBM 內(nèi)的超分子結(jié)構(gòu)，作者使用與 Alexa 647（一種明亮的熒光光敏染料）結(jié)合的抗體對(duì)腎臟切片中的腎小球進(jìn)行了 STORM 成像。
由于 GBM 內(nèi)致密的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生了強(qiáng)烈的熒光背景和光散射，對(duì)從腎臟切片獲取高分辨率 STORM 數(shù)據(jù)構(gòu)成障礙，作者對(duì)固定和組織切片方法進(jìn)行了改進(jìn)，并最終確定在 200 納米(nm)厚度下對(duì) Tokuyasu 冷凍包埋和冷凍切片最佳。
為了研究集聚蛋白（GBM的主要HSPG成分）在GBM中的組織，作者首先用抗集聚蛋白 C 的抗體標(biāo)記腎切片，與傳統(tǒng)的 agrin 免疫熒光圖像相比，STORM 在 GBM 中解析了兩個(gè)不同的 agrinC 層（圖1-A，圖1-B）。
圖1、鼠GBM的STORM和STORM-EM圖像相關(guān)性
為了定量記錄 agrinC（集聚蛋白的 C 端 ）的分布，作者數(shù)字化選擇了腎小球的多個(gè)區(qū)域。通過抗 agrinC 和唾液蛋白 podocalyxin 的抗體進(jìn)行雙重標(biāo)記，對(duì) GBM 與側(cè)翼足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的關(guān)系進(jìn)行成像，后者在內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞表面都有表達(dá)。雙通道 STORM 成像顯示，兩層 agrinC 確實(shí)位于兩層 podocalyxin 之間（圖1-E、圖1-F和圖1-圖補(bǔ)充 1）。
圖1-圖補(bǔ)充1、EM/STORM相關(guān)的低放大倍率圖像
為了進(jìn)一步關(guān)聯(lián) STORM 分子定位，作者開發(fā)了一種混合 STORM-電子顯微鏡 (EM) 方法（參見圖1-圖補(bǔ)充2中的示意圖），同樣也證實(shí)了 GFB 的超微結(jié)構(gòu)特征。
圖1-圖補(bǔ)充2、示意圖顯示處理樣品的步驟
2、在 GBM 內(nèi)定位分子
在建立了樣本制備、STORM 成像和 EM 相關(guān)性的方法后，通過比較各種 ECM 組件的位置來分析 GBM 的分子組織。利用 agrinC 的穩(wěn)健和雙峰分布，作者使用了一種定位方案，其中兩個(gè) agrinC 層之間的中心位置被設(shè)置為原點(diǎn)，第二個(gè)蛋白質(zhì)的位置，與 agrinC 一起通過雙色 STORM 成像，通過在多個(gè)區(qū)域和腎小球上重復(fù)該過程，可以高精度地確定 GBM 中各種蛋白質(zhì)表位的位置。本研究中繪制的各種 ECM 蛋白及其表位如圖2-圖補(bǔ)充1所示。
圖2、在GBM內(nèi)定位分子結(jié)構(gòu)域
圖 2-圖補(bǔ)充1、抗原表位與Agrin、Laminin和Collagen IV結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系
3、腎小球基底膜成分在Alport綜合征小鼠模型中的分布
腎小球基底膜（GBM）成分的獨(dú)特分布促使作者評(píng)估 GBM 的組織是否在基底膜的特定疾病中受到破壞。因此，作者分析了常染色體隱性遺傳 Alport 綜合征的小鼠模型，該模型由于 COL4A3 無效突變而缺乏膠原α3α4α5（IV）網(wǎng)絡(luò)。
在人類和小鼠中，該網(wǎng)絡(luò)的缺乏會(huì)導(dǎo)致膠原 α1α1α2（IV）表達(dá)的代償性增加，通常會(huì)在成人 GBM 中以低水平被發(fā)現(xiàn)。盡管有這種代償作用，GBM 仍會(huì)出現(xiàn)節(jié)段性分裂和增厚，這與血尿、蛋白尿和進(jìn)行性腎功能衰竭有關(guān)。
為了研究該疾病模型中 GBM 的結(jié)構(gòu)，作者檢測(cè)了 agrinC 和膠原α1α1α2（IV）的組織，最終得出結(jié)論，完整的膠原 α3α4α5（IV）網(wǎng)絡(luò)有助于維持健康 GBM 中聚集蛋白和膠原 α1α1α2（IV）的組織。（圖3）
圖3、Alport綜合征小鼠模型中GBM分子結(jié)構(gòu)的分解
03研究總結(jié)
確定細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（ECM）的結(jié)構(gòu)、分子相互作用以及空間組織是理解其在組織功能、形態(tài)發(fā)生和疾病中發(fā)揮作用的重要步驟。該研究描述了一種新的超分辨率熒光顯微鏡方法來重建 GBM 內(nèi) ECM 蛋白的分子結(jié)構(gòu)，并且通過使用 STORM 和 EM 對(duì)同一樣品進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)成像，實(shí)現(xiàn)了在致密組織切片中觀測(cè)系統(tǒng)的納米級(jí)分子映射。這種方法的穩(wěn)健和相對(duì)快速的吞吐量使我們能夠重建小鼠和人類惡性膠質(zhì)瘤（GBMs）的分子結(jié)構(gòu)。
圖4、力顯智能自主研發(fā)的超高分辨率顯微成像系統(tǒng)iSTORM
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參考文獻(xiàn)：
Hani Suleiman, Lei Zhang, Robyn Roth, John E Heuser, Jeffrey H Miner, Andrey S Shaw, Adish Dani (2013) Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane eLife 2:e01149
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