什么是隨機光學重建顯微鏡STORM？
它有什么應用？
高爾基體轉運網絡（TGN）和核內體是分泌轉運途徑中重要的蛋白質分選站。蛋白質分選基本上是一個空間分離的過程，但在哺乳動物細胞中，尚未以高分辨率系統地分析構成分選機制的蛋白質之間的空間關系。在這里，作者借助STORM成像，表明TGN/內涵體定位的貨物銜接子AP-1，GGA2和epsinR，在近核高爾基體區域形成長度超過250納米的伸長結構。作者的數據表明，TGN/內涵體定位的貨物銜接子具有明顯的空間關系。空間分離的貨物銜接子GGA2和AP-1分別調節Frizzled6和Vangl2的分選，并且空間相關的貨物銜接子可以協同調節特定的分選過程。
NO.1研究介紹（節選）
在這里，作者利用隨機光學重建顯微鏡（STORM）以高分辨率提供參與TGN/內體分選過程的蛋白質空間分布的更廣泛視圖。STORM成像在同一照相機幀中同時捕獲兩種熒光染料以實現20nm的空間分辨率。作者揭示了貨物銜接子AP-1和GGA2是空間分離的，它們分別介導平面細胞極性蛋白Vangl2和Frizzled6的分選。超分辨率成像研究顯示Frizzled6和Vangl2在空間上與不同的網格蛋白銜接子相關，提供了差異貨物分選過程的直接觀察。
NO.2研究結果（節選）
1.網格蛋白與TGN/內體定位的貨物銜接子的空間關系分析
為了測試STORM是否可以用于比較不同高爾基體定位蛋白之間的空間關系，作者分析了順式高爾基體標記GM 130和反式高爾基體標記Golgin-97的定位模式。使用常規光學顯微鏡，GM 130的定位模式與Golgin 97的定位模式沒有明顯區別（圖1A）,相反，用STORM，作者觀察到GM 130與Golgin-97的明顯分離（圖1B，C）。因此，STORM是揭示不同高爾基體定位蛋白質之間空間關系的可行工具。
（A，B）通過常規熒光顯微鏡（A）或通過STORM（B）可視化的相同COS7細胞中的順式高爾基體標記（GM130）和反式高爾基體標記（高爾基體-97）的定位模式。比例尺，500 nm。(C)（B）中所示區域的放大圖。比例尺，100 nm。(D)STORM技術揭示了兩種不同熒光染料標記的順式高爾基體標記物（GM130）在COS7細胞中的定位模式。比例尺，500 nm。(E)（D）中所示區域的放大圖。比例尺，100 nm。(F)基于從每個實驗組中的一個實驗獲得的四個超分辨率圖像，量化GM130和Golgin-97之間以及Alexa Fluor 750標記的GM130和Alexa Fluor 647標記的GM130之間的重疊像素百分比（平均值± SD）。* ** p〈0.001，采用雙尾Student t檢驗。超分辨率圖像顯示了所指示蛋白在整個核旁區域中的定位模式。圖中的每個點代表每個單個細胞的整個近核高爾基區的數據。
使用STORM，作者試圖分析COS7細胞中網格蛋白和貨物銜接子之間的空間關系。作者選擇了大部分貨物銜接子位于其中的整個近核高爾基區用于以下超分辨率成像分析。這一分析表明，STORM可以檢測到網格蛋白在囊泡外殼周圍的環狀定位。
圖2 近核區貨物銜接子與網格蛋白的空間關系分析
(A-G用抗網格蛋白重鏈和γ 1-adaptin的抗體共染色COS7細胞。應用STORM技術分析了γ 1-adaptin標記的AP-1和網格蛋白重鏈標記的網格蛋白在COS7細胞中的二維（A-C）和三維（D-G "）定位模式。（A，D）中指示區域的放大圖分別顯示在（B，C）和（E-G "）中。(H-K'）.用epsinR-FLAG轉染COS7細胞。轉染后第1天，細胞用抗γ 1-adaptin抗體和FLAG標簽共染色。STORM分析同一COS7細胞中epsinR-FLAG和網格蛋白重鏈的空間定位模式。（H）中指定區域的放大圖見（I-K "）。(L-O用抗網格蛋白重鏈和GGA2的抗體共染色COS7細胞。STORM技術分析GGA2和網格蛋白重鏈在同一COS7細胞中的三維定位模式。（L）中指定區域的放大圖見（M-O "）。(P-R)COS7細胞與抗網格蛋白重鏈和AP3 δ 1的抗體共染色。應用STORM分析AP3 δ 1和網格蛋白重鏈標記的AP-3在COS7細胞中的二維定位模式。圖P中所示區域的放大圖顯示在（Q，R）中。(S)基于每個實驗組3次獨立重復采集的超分辨率圖像，定量與網格蛋白相關的AP-1、GGA2、AP-3或epsinR斑點組分（平均值± SD，基于≥ 9張超分辨率圖像）。超分辨率圖像顯示了所指示蛋白質在整個近核區域中的定位模式，其中定位了大多數貨物銜接子。圖中的每個點代表每個單個細胞的整個近核高爾基區的數據。
2.TGN/核內體定位的貨物銜接子空間關系分析
接下來，作者以精細分辨率分析了TGN和內體定位的貨物銜接子之間的空間關系。
AP-1和epsinR的超分辨率成像分析顯示一些epsinR結構與AP-1結構相關（圖3E-H，和圖3I中的定量）和一些AP-1和epsinR結構彼此分離（圖3E，G）。
圖3 近核區網格蛋白銜接子的空間關系分析
(A-D，N-Q）COS 7細胞與γ1-adaptin和δ3-adaptin抗體共染色或與γ1-adaptin和GGA 2抗體共染色。然后使用STORM來可視化AP-1和AP-3的定位（A-D）以及AP-1和GGA 2的定位（N-Q）。(E-H，J-M）。用epsinR-FLAG轉染COS 7細胞。轉染后第1天，用抗γ1-適應素和FLAG標簽的抗體（E-H）或抗GGA 2和FLAG標簽的抗體（J-M）對細胞進行共染色。然后使用STORM可視化γ1和epsinR-FLAG的定位以及GGA 2和epsinR-FLAG的定位。（A、E、J、N）中指定區域的放大視圖如（B-D、F-H、K-M、O-Q）所示。顯示了每個面板的比例尺。（I，R）定量與epsinR或AP-3相關的AP-1斑點百分比（I），定量與epsinR或AP-1相關的GGA 2斑點百分比（R）（平均值± SD，基于≥7張超分辨率圖像）。***p〈0.001，采用雙尾Student t檢驗。AP-1和AP-3分別用抗γ1和δ3抗體標記。超分辨率圖像顯示了所指示蛋白質在整個近核區域中的定位模式，其中定位了大多數貨物銜接子。圖中的每個點代表每個單個細胞的整個近核高爾基區的數據。定量分析基于從每個實驗組的三次獨立重復獲得的超分辨率圖像。
3.通過超分辨率成像分析可視化平面細胞極性蛋白Vangl2和Frizzled6在TGN離開時的分選
作者選擇了大部分Vangl2定位的近核區域用于超分辨率成像分析。STORM成像分析顯示，大多數Vangl2 Y279A、Y280A點狀結構不與AP-1相鄰（圖4J、U）。接下來作者試圖用STORM觀察這些分選過程。
圖4 Vangl2和Frizzled6在通過STORM退出TGN時的分類可視化
(A-H用HA-Vangl2（wt）轉染COS7細胞。轉染后第1天，將細胞在20 ℃下孵育2 h，然后在32 ℃下孵育5 min。孵育后，用STORM觀察Vangl2（wt）和AP-1 γ亞基在二維（A-D）和三維（E-H "）的定位。（A）中指示區域的放大圖見（B-D）。（E）中指示區域的放大圖見（F-H）。（F-H）的180 °旋轉視圖如（F'- H'）所示。顯示了每張圖像的比例尺。(I-K)用HA-Vangl2（wt）或HA-Vangl2 Y279A、Y280A或HA-Frizzled6轉染COS7細胞。轉染后第1天，將細胞在20 ℃下孵育2 h，然后在32 ℃下孵育5 min。孵育后，用STORM觀察Vangl2（wt）和AP-3 δ亞基（I），Vangl2 Y279A、Y280A和AP-1 γ亞基（J），Frizzled6和AP-1 γ亞基（K）的定位。比例尺，500 nm。(L-Q)COS7細胞用HA-Vangl2（L）或HA-Frizzled6（M-P）轉染或用epsinR-FLAG和HA-Frizzled6（Q-T）共轉染。轉染后第1天，將細胞在20 ℃下孵育2 h，然后在32 ℃下孵育5 min。溫育后，使用雙色STORM來顯現Vangl2和GGA2（L）、Frizzled6和GGA2（M-P）或epsinR-FLAG和Frizzled6（Q）的定位。（M，Q）中指示區域的放大圖如（N-P，R-T）所示。(U)與指定貨物相關的Vangl2或Frizzled6斑點百分比的定量|適配器（平均值± SD，基于每個實驗組≥ 6張超分辨率圖像）。* * p〈0.01，*** p〈0.001，采用雙尾Student t檢驗。超分辨率圖像顯示了所指示蛋白質在整個近核區域中的定位模式，其中定位了大多數貨物銜接子。圖中的每個點代表每個單個細胞的整個近核高爾基區的數據。定量分析基于從每個實驗組的三次獨立重復獲得的超分辨率圖像。(V)所提出的模型顯示AP-1、AP-3、epsinR和GGA2在TGN和內體膜上的不同微結構域上組裝成具有不同空間關系的伸長結構：空間分離的GGA2和AP-1分別調控Frizzled6和Vangl2的分選;空間相關的貨物銜接子GGA2和epsinR共同調節Frizzled6的分選。
NO.3研究討論（節選）
STORM超高分辨率成像分析也揭示了AP1結構與GGA2結構在很大程度上是分離的，并且至少存在兩個epsinR群，一個與AP-1相關，另一個與GGA2相關（圖4V）.在酵母中，這些觀察結果表明，從酵母到哺乳動物細胞，貨物銜接子之間的空間關系是保守的。
總之，STORM超高分辨率成像分析表明，貨物銜接子AP-1、AP-3和GGA 2在TGN或核內體的不同出口結構域組裝成大的細長結構，以介導特定貨物分子的分選（圖4V）。空間分離的GGA 2和AP-1分別調節Frizzled 6和Vangl 2的分選。空間相關的貨物銜接子GGA 2和epsinR共同調控Frizzled 6的分選。
在本研究中，研究者主要借助STORM超分辨率顯微鏡來研究高爾基體網絡和內體蛋白質分選可視化，目前在國內，隨機光學重建顯微鏡STORM已成功實現商用，有需要STORM成像技術進行實驗研究的專家老師們，可預約獲得 iSTORM 超高分辨率顯微成像系統試拍服務~
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寧波力顯智能科技有限公司（IN文末可預約超高分辨率顯微成像系統 iSTORM試拍！VIEW）是專業從事超高分辨率顯微技術和產品研發的科技企業，依托復旦大學的自動控制、新一代信息技術及香港科技大學的生物、光學、圖像處理等的技術，擁有光學、生物、自控、機械、信息技術等多領域交叉學科技術團隊，將2014年諾貝爾化學獎技術產業化，推出了超高分辨率顯微成像系統iSTORM、細胞智能監控助手賽樂微等一系列產品，幫助人們以前所未有的視角觀察微觀世界，突破極限，見所未見。
