光學(xué)科普

商業(yè)熒光顯微鏡的光源通常選用鹵素?zé)艋蚓哂袑拵Ч獾碾簟?/span>其中寬帶光一般用于常規(guī)目視觀察和熒光激發(fā)。考慮到光激發(fā)的效率，在激發(fā)過程中，一般僅使用部分在特定光譜中可被染料（熒光模塊）吸收的發(fā)射光，大部分來自光源的光會被不同類型的濾光片阻擋。

不過，由于制造缺陷，實際操作中，這些濾光片可能并不能理想地阻擋所有不需要的光，這樣就會造成漏光，漏光會產(chǎn)生噪點并降低圖像質(zhì)量，這也是很多顯微鏡圖像質(zhì)量不高的原因。

圖1、顯微鏡照明傳統(tǒng)光源光譜

此外，因為大多數(shù)光能位于吸收光譜區(qū)域之外，濾光片還會浪費燈的大部分能量，這意味著在熒光模式下操作顯微鏡時，我們需要更強大的光源，否則視圖中的圖像場將變得更暗和模糊。如果發(fā)射的光譜可以適合能量吸收染料范圍，我們可以有更明亮的視野和更強的信號。所以，一個具有出色發(fā)光效率的光源對顯微鏡非常重要。

在過去的十年中，發(fā)光二極管 (LED) 技術(shù)發(fā)展迅速，光效突破了100Lm/W大關(guān)。高光效使 LED 能夠在許多應(yīng)用中取代傳統(tǒng)燈。此外，LED 還具有出色的色彩表現(xiàn)、更長的使用壽命等其他優(yōu)點。經(jīng)研究實驗顯示，使用單色 LED 是激發(fā)熒光分子的一個很好的解決方案，我們可以選擇對應(yīng)光譜的LED光源作用于各種工作熒光分子。

圖2、LED光譜

研究人員 Herman 提出了一種使用 LED 作為光源的頻域熒光顯微鏡。Hohman 將這種新的 LED 技術(shù)整合到 Colibri 照明系統(tǒng)中。Bormuth 在熒光顯微鏡中應(yīng)用了不同顏色的 LED，可有效抑制 2視頻增強DIC的外圍光。Hanscheid采用低成本和長壽命 LED 取代熒光顯微鏡中更昂貴的汞燈以檢測結(jié)核病 。Albeanu 介紹了使用簡單的光管來耦合從 LED 光源發(fā)射到熒光顯微鏡的光。馬丁等人和格哈特等人分別在 2009 年和 2011 年使用 LED 光源檢測單個分子。

圖3、LED 結(jié)合 科勒照明光路示意圖

此外，大功率應(yīng)用中的 LED 采用陣列設(shè)計形式來增強圖像的照明。然而，無論是單個 LED 還是 LED 陣列設(shè)計都面臨一個關(guān)鍵問題，即來自 LED 的光具有大發(fā)散角和寬發(fā)光表面積。因此，具有出色光能聚集能力的 LED 照明系統(tǒng)是熒光顯微鏡所必需的，可以為樣品提供更亮的照明和較低的電功耗。在傳統(tǒng)光源時代，科勒照明方式具有較好的優(yōu)勢，因此可以考慮LED采用科勒照明。

圖4、利用TIR透鏡對樣本的照明示意圖

考慮到LED區(qū)別傳統(tǒng)光源的特點，工程師們還針對LED研發(fā)了專門的全反射（TIR）透鏡，上圖是利用TIR透鏡做的針對樣本的照明。總之，隨著LED技術(shù)的發(fā)展，它在顯微鏡領(lǐng)域的應(yīng)用價值將越來越大。