什么是隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM？
??它有什么應(yīng)用？??
“ 細(xì)菌通過(guò)將新物質(zhì)組裝成其表面膜以控制其生長(zhǎng)和分裂。在活細(xì)菌細(xì)胞中使用超分辨率顯微鏡和原位交聯(lián)，以可視化BAM復(fù)合物之間的親密接觸，這表明細(xì)菌使用高度組織化的區(qū)域來(lái)驅(qū)動(dòng)膜蛋白組裝。 ”
01研究介紹
β-barrel assembly machinery complex（BAM復(fù)合物）對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白的定位至關(guān)重要，但其作用機(jī)制尚不清楚。作者開(kāi)發(fā)了一種直接的隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(dSTORM)方法來(lái)在原位查看BAM復(fù)合體。單細(xì)胞分析表明，包含多個(gè)BAM復(fù)合物的離散膜區(qū)分布在大腸桿菌表面，最近鄰距離為~200nm。輔助脂蛋白亞基BamB對(duì)這種空間分布至關(guān)重要，原位交聯(lián)表明，BamB與該區(qū)域內(nèi)鄰近BAM復(fù)合物中的BamA和BamB有密切接觸。當(dāng)外膜蛋白合成最大時(shí)，BAM復(fù)合物區(qū)域膨脹，這直觀地證明了該區(qū)域在蛋白質(zhì)組裝中是活躍的。這種對(duì)BAM復(fù)合物的納米級(jí)原位詢問(wèn)提出了一個(gè)模型，即細(xì)菌外膜包含高度有組織的組裝區(qū)域來(lái)驅(qū)動(dòng)整合的蛋白質(zhì)組裝。
02研究結(jié)果（節(jié)選）
1、BAM復(fù)合體
在革蘭氏陰性菌中，外膜是細(xì)菌的外表面。β-barrel蛋白構(gòu)成了該外膜質(zhì)量的主要部分，其作用范圍從簡(jiǎn)單營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的被動(dòng)擴(kuò)散到一系列特異性性狀。這些蛋白質(zhì)的組裝取決于構(gòu)成β-barrel組裝機(jī)制(BAM)的一系列因素，其主要和必要的組成部分是核心BAM復(fù)合物。BAM配合物的催化功能依賴于一個(gè)必要的亞基，BamA。但BAM復(fù)合物將β-barrel蛋白組裝成細(xì)菌外膜的確切機(jī)制仍有待闡明。BAM復(fù)合物的結(jié)構(gòu)可以從單個(gè)組分的晶體結(jié)構(gòu)來(lái)理解：BamA、BamB、BamC、BamD以及BamE，五種亞基共同構(gòu)建成BAM復(fù)合體，其中BamB是WD40蛋白，BamC是Helix-grip蛋白，BamD是四肽重復(fù)蛋白。
圖1.BAM復(fù)合物的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)
目前的理解是，每個(gè)BamA分子與其他BAM亞基中的一個(gè)分子相互作用，BamC暴露在外膜的外表面，BamB、BamD和BamE暴露在基質(zhì)中。
圖2.重建3個(gè)大腸桿菌細(xì)胞BamA的dSTORM成像
（左上）dSTORM重建的超分辨率圖像顯示感興趣的區(qū)域(ROI)，（中上)為對(duì)應(yīng)區(qū)域生成的熱圖，(右上)邊緣效應(yīng)過(guò)濾二進(jìn)制掩模，顯示用于區(qū)域分析的閾值。
圖3.測(cè)量顯示大腸桿菌細(xì)胞中BamA平均（左)區(qū)域密度和(右）直徑
2、BamB是BAM配合物相互作用的關(guān)鍵
從結(jié)構(gòu)上講，BamB是一種WD40蛋白，和WD40 β-螺旋槳結(jié)構(gòu)可以將單元復(fù)合物結(jié)合成超級(jí)復(fù)合物，例如在分泌囊泡周?chē)墓苍訉雍秃丝讖?fù)合體的膜附著晶格。在這些原型陣列中，WD40蛋白亞基同時(shí)進(jìn)行異型和同型的相互作用，以穩(wěn)定更大的結(jié)構(gòu)。因此，作者試圖解決WD40蛋白BamB的功能是將BAM復(fù)合物組織成細(xì)菌外膜區(qū)域的假設(shè)。
圖4.BamB結(jié)構(gòu)
圖5.BamAB的結(jié)構(gòu)
表示插入BamB的BPA殘基的位置（用紫色球體表示）BamB的正統(tǒng)面和非正統(tǒng)面的鏈間環(huán)分別用紅色和綠色表示。
圖6.野生型大腸桿菌和△BamB突變體的dSTORM成像
這些DbamB突變體的dSTORM成像顯示，在沒(méi)有BamB的情況下，BAM復(fù)合物的區(qū)域定位缺失。在△BamB突變體中，區(qū)域密度和BAM復(fù)合物的比例均有顯著差異。BAM復(fù)合物的平均區(qū)域面積從7801±221nm2（野生型）減少到4232±353nm2（△BamB)，在沒(méi)有BamB的情況下，只有26%的BAM復(fù)合物在這些較小的殘余定位中被發(fā)現(xiàn)。
03研究總結(jié)
以上，作者使用超分辨率成像結(jié)合完整的大腸桿菌原位交聯(lián)展示BAM復(fù)合物的組織區(qū)域結(jié)構(gòu)，dSTORM技術(shù)應(yīng)用于大腸桿菌的拍攝，能夠精確地識(shí)別其表面BAM復(fù)合體的結(jié)構(gòu)并限定它們的尺寸，形態(tài)以及大小。通過(guò)揭示以前沒(méi)有被精細(xì)可視化的新特征，進(jìn)一步了細(xì)菌表面蛋白的裝配機(jī)制。為當(dāng)前各項(xiàng)相關(guān)研究提供了新的思路與見(jiàn)解。
在本研究中，研究者主要借助STORM超分辨率顯微鏡來(lái)研究大腸桿菌表面蛋白，目前在國(guó)內(nèi)，隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM已成功實(shí)現(xiàn)商用 ，有需要STORM成像技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的專(zhuān)家老師們， 請(qǐng)文末填寫(xiě)問(wèn)卷， 即可預(yù)約獲得 iSTORM 超高分辨率顯微成像系統(tǒng)試拍服務(wù)~
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參考文獻(xiàn)
References
1. Gunasinghe, Sachith D., et al. "The WD40 protein BamB mediates coupling of BAM complexes into assembly precincts in the bacterial outer membrane." Cell reports 23.9 (2018): 2782-2794.
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