文獻解讀 知識分享
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研究介紹（節(jié)選）
腎臟疾病的診斷非常復雜且具有挑戰(zhàn)性，通常需要使用到光學顯微鏡（LM）、免疫組織學和電子顯微鏡（EM）。EM在~50%的天然腎活檢的組織病理學中比較有用，對~20%的診斷也是十分重要，這使得EM在許多國家/地區(qū)成為天然腎活檢檢查的標準技術。EM常用于診斷與基底膜結構異常、原纖維疾病和罕見的遺傳性疾病相關的腎臟疾病。它也經(jīng)常用于記錄足細胞的形態(tài)變化，并記錄免疫復合物或補體片段沉積物的形狀、亞結構和相對于腎小球基底膜 （GBM）的位置。
然而，目前世界上大部分人都無法使用上EM儀器，且在可使用的地方，相關的專家和設施的數(shù)量也正在減少。對于發(fā)展中國家和發(fā)達國家來說，找到一種更便宜的EM替代品，來增強診斷能力，超越LM和IF，減少所需的儀器數(shù)量、簡化和加速診斷工作流程，是非常重要的。
近年，光學顯微鏡已經(jīng)通過超分辨顯微鏡（SRM）技術突破了衍射極限，如結構化照明顯微鏡（SIM）、隨機切換單分子定位顯微鏡（SMLM）技術、光激活定位顯微鏡和隨機光學重建顯微鏡（STORM）等。
如直接隨機光學重建顯微鏡（dSTORM）的技術所示.在之前一種作者稱之為“easySTORM”的方法中，作者已經(jīng)證明了dSTORM可以使用多模二極管激光器和多模光纖以相對較低的成本（<20,000 英鎊）在大視場上（>120 × 120 μm）穩(wěn)定提供超分辨圖像。作者表明，這種方法可以應用于臨床組織學切片，以使用臨床批準的抗體提供超分辨率的IF成像。作者將其描述為“histoSTORM”方法。
作者特別探討了在腎臟疾病診斷中，用histoSTORM取代EM的可能性，或許能提供一種儀器成本較低的、能夠廣泛使用的臨床工具。這是在早期使用SIM 和STORM 研究GBM中的腎足細胞亞結構和蛋白質組織的工作之后進行的。雖然之前的工作證明了超分辨IF的潛力，但它是通過昂貴的商業(yè)SRM儀器實現(xiàn)的，并且利用STORM的研究是用小鼠組織和非臨床批準的抗體進行的。
作者的目標是開發(fā)一種低成本的方法，讓大部分國家地區(qū)的臨床醫(yī)生可以使用“easySTORM”對臨床相關蛋白質進行成像，并且能使用現(xiàn)有的臨床驗證抗體制定實用方案來處理現(xiàn)有的活檢樣本，如冷凍切片或石蠟（FFPE）切片等。作者注意到STORM以前已被應用于病理學研究，例如研究表觀遺傳調節(jié)和癌癥的進展等。
02
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研究結果
在最初的小型研究中，作者將帶有標準臨床批準抗體的 histoSTORM 應用于 FFPE 和冷凍組織切片。作者相信下面呈現(xiàn)的示例性結果顯示了可能有助于診斷的、具有臨床意義的超微結構。
膜性腎小球腎炎（圖1）的特征是基底膜內膜含有IgG的上皮下免疫復合物沉積物，且該結構增厚。圖1D中的雙色寬視場IF圖像顯示了一個毛細管環(huán)，其中GBM為綠色，帶有抗人層粘連蛋白探針（綠色，Alexa Fluor 555），過濾屏障上皮側的IgG沉積物為紅色（IgG，iFluor 647）。以每像素25nm顯示的dSTORM圖像顯示了與EM觀察到的圖像一致的定義明確的上皮下沉積物（圖1F，I）。雖然在寬視場IF圖像中沒有明確的結構定義（圖1D，G），但在dSTORM中很容易觀察到上皮下區(qū)域的免疫沉積物的細節(jié)和免疫沉積物含量的梯度（圖1E，H）。dSTORM圖像的綠色區(qū)域表示無免疫沉積物的GBM區(qū)域，黃色區(qū)域表示層粘連蛋白和免疫沉積物的重疊，紅色區(qū)域表示免疫沉積物簇。
圖1、膜性腎小球腎炎。基底膜（層粘連蛋白，綠色 - Alexa Fluor 555）和IgG沉積物（紅色 - iFluor 647）。
（A–C）膜性腎小球腎炎冷凍切片×100倍放大的寬視場IF圖像顯示。
（A）層粘連蛋白通道。
（B）IgG通道。
（C）在（A）和（B）中由黃色方塊指示的區(qū)域的擴展雙通道圖像。
（D）由（C）中黃色正方形表示的區(qū)域的寬視場 IF。
（E） 像素大小為 25 nm 的相應 STORM 圖像。
（F）在×5500倍放大率下從同一活檢中獲得類似結構的電子顯微鏡照片。
（G）在（D）和 （E）中指出的3.2 × 2.4 μm 的2區(qū)域寬視場 IF 圖像。
（H）對應的 STORM 圖像。
（I）在（F）所示區(qū)域的擴展電子顯微鏡圖像。
黃色虛線表示淺灰色的 GBM。上皮下側的深灰色電子致密沉積物（紫色箭頭）代表含有IgG的免疫復合物。
狼瘡性腎炎的特征是多克隆 IgG 在腎小球不同區(qū)域的腎小球沉積 。圖2顯示了Iv期狼瘡腎炎腎小球毛細血管中IgG（紅色，iFluor 647）的沉積和基底膜染色（層粘連蛋白，綠色，Alexa Fluor 555）。在此階段，系膜（圖2G），內皮下（圖2H）和上皮下（圖2I）IgG沉積物很容易用dSTORM觀察到，并概括了用EM記錄的高電子密度IgG沉積物的分布（圖2C）。
圖2、狼瘡性腎炎IV型。基底膜（層粘連蛋白，綠色 - Alexa Fluor 555）和IgG沉積物（紅色 - iFluor 647）。
（A）冷凍切片×100放大倍率下的寬視場IF圖像，顯示IV型狼瘡性腎炎，所選區(qū)域存在（D，G）系膜沉積物，（E，H）內皮下沉積物和（F，I）上皮下沉積物。
（B） 對應于（A），以像素大小為25 nm 顯示的 STORM 圖像。
（C）以×8000倍放大率從同一樣品獲得類似結構的電子顯微照片，在GBM的上皮下側（紫色箭頭），在BBM的內皮下側（藍色箭頭）和系膜（黃色星）中偶爾顯示含有IgG的電子致密沉積物。
（G–I）對應于寬視場 IF 圖像 （D–F） 的STORM圖像。
（D）和（G）顯示（A）和（B）中的黃色正方形所指示的區(qū)域。
（E）和（H）顯示（A）和（B）中的青色方塊所指示的區(qū)域。
（F）和 （I）顯示（A）和（B）中的紫色正方形所指示的區(qū)域。
easySTORM提供了分辨率低于衍射極限的大視場（120μm×120μm）允許評估腎小球毛細血管中的GBM厚度并記錄腎小球的其他方面。圖3A、C顯示了來自微小變化疾病活檢的FFPE切片的寬視場落射熒光圖像，其中GBM中的層粘連蛋白用iFluor 647標記。圖3B、D顯示了相應的STORM圖像，并確認了STORM圖像在衍射極限以下進行GBM厚度測量的能力。圖3F、G顯示了通過GBM的寬視場和STORM圖像的線段。圖3E顯示了GBM寬度為281nm的電子顯微鏡照片。
圖3、微小變化病：GBM厚度測量（層粘連蛋白-iFluor 647）。
（A） FFPE 部分放大倍率為 ×100 倍的寬視場 IF 圖像。
（B）（A）中所示區(qū)域的渲染風暴圖像。
（C）（A）中黃色框中所示區(qū)域的寬視場插圖。
（D）（B）中黃色框中所示區(qū)域的 STORM 插圖，像素大小為 25 nm。
（E）從同一活檢的不同部分以×15500倍放大倍率拍攝的GBM的電子顯微鏡照片，其指定位置的GBM厚度為281nm。
(F) 在黃線 (657 nm) 位置從寬場 IF 圖像 (C) 測量的 GBM 厚度 (半高全寬)。
(G) 風暴圖像 (D) 在黃線 (212 nm) 位置的測量厚度 (半高全寬)。
03
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超高分辨顯微成像系統(tǒng)iSTORM
目前，在國內，隨機光學重建顯微鏡STORM已成功實現(xiàn)商用， 現(xiàn)已發(fā)布的超高分辨率顯微成像系統(tǒng) iSTORM，成功實現(xiàn)了光學顯微鏡對衍射極限的突破，使得在 20納米的分辨率尺度上從事 生物大分子的單分子定位與計數(shù) 、 亞細胞及超分子結構解析 、 生物大分子生物動力學 等的研究成為現(xiàn)實，從而給生命科學、醫(yī)學等領域帶來重大突破 。
超高分辨率顯微成像系統(tǒng) iSTORM 具有 20 納米超高分辨率、3通道同時成像、3D同步拍攝、實時重構、2小時新手掌握 等特點，并提供熒光染料選擇、樣本制備、成像服務與實驗方案整體解決方案， 以納米級觀測精度、高穩(wěn)定性、廣泛環(huán)境適用、快速成像、簡易操作等優(yōu)異特性，獲得了超過50家科研小組和100多位科研人員的高度認可。
參考文獻
Garcia E, Lightley J, Kumar S, Kalita R, G?rlitz F, Alexandrov Y, Cook T, Dunsby C, Neil MA, Roufosse CA, French PM. Application of direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) to the histological analysis of human glomerular disease. J Pathol Clin Res. 2021 Sep;7(5):438-445. doi: 10.1002/cjp2.217. Epub 2021 May 21. PMID: 34018698; PMCID: PMC8363924.
